水溶性糖与烟草品质关系密切，糖在卷烟燃吸时产生酸性物质，抑制烟气中的碱性物质，平衡烟气酸碱度，降低刺激性；糖还能与氨基酸发生美拉德反应，形成多种香气物质，产生令人愉快的香气。此外，水溶性糖能使烟叶柔软，富有弹性，色泽鲜亮。烟叶中含糖量过高则会使烟气吃味平淡，浓度和香气不足，劲头和强度减弱，影响烟叶的燃烧性，使阴燃变差，燃烧不完全。研究表明，影响烤烟水溶性总糖和还原糖含量的主要因素有品种、栽培措施和生态环境等，而片烟陈化对两糖含量也有一定影响。总糖与还原糖均与烟叶感官评吸质量显著正相关，对降低刺激性、消除杂气、增强感官柔细度有显著贡献。另外两糖含量还显著影响烤烟香型特色彰显度，总糖正向直接影响中间香型特色彰显度，还原糖负向直接影响中间香型特色彰显度，其中总糖对中间香型烤烟烟气成分的贡献较大。烟草行业一般采用连续流动分析仪测定水溶性总糖和还原糖的百分含量，但每种糖的含量则无从知晓。目前测定果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等水溶性糖的方法主要有离子色谱法、气相色谱法、液相色谱示差折光检测法、液相色谱蒸发光散射检测法等。其中，离子色谱法对样品的分析效率相对较低；气相色谱法需要样品衍生化才能测定，相对繁琐；液相色谱差折光检测法对温度敏感，稳定性相对较差；液相色谱蒸发光散射检测法的选择性稍差。超高效液相色谱 – 串联质谱法具有分析效率高，选择性好，灵敏度高的优势，非常适合样品的高通量分析，然而目前尚无超高效液相色谱 – 串联色谱测定卷烟中水溶性糖的文献报道。笔者建立超高效液相色谱 – 串联质谱法测定云产卷烟中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖 4 种水溶性糖的含量，该方法利用样品中水溶性糖含量较高的特点，采用高倍稀释以降低基质效应，无需采用固相萃取对样品进行净化处理，该方法样品分析速度更快，准确度更高。另外，根据水溶性糖的含量对云产卷烟进行聚类分析，以期为烟草加工、卷烟配方、卷烟产品开发与维护等提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  超高效液相色谱仪：Waters [**]cquity 型，美国沃特世公司；

  串联质谱仪：Waters Quattro Premier 型，美国沃特世公司；

  超声波清洗机：JP–080 型，40 kHz，深圳洁盟清洗设备有限公司；

  超纯水机：Milli-Q 型，德国默克密理博公司；台式离心机：5804 型，德国艾本德公司；

  甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵：色谱纯，美国飞世尔科学世界公司；

  果 糖、葡 萄 糖、蔗 糖、麦 芽 糖 标 准 品：纯 度 均大 于 99.0%，C[**]S 号 分 别 为 57–48–7，50–99–757–50–1，69–79–4，北京盈祥科技有限公司；

  卷烟样品：40 种，产地为云南，市售。

1.2 溶液配制

分别称取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品各0.100 0 g 于 4 只 100 mL 容量瓶中，用纯水定容至标线，配制成 4 种水溶性糖的质量浓度均为 1 mg／mL的单一标准储备液。然后移取葡萄糖和果糖单一标准储备液各 1 mL 于 1 只 10 mL 容量瓶中，用体积浓度为 50% 的乙腈定容至标线，得葡萄糖和果糖的质量浓度均为 100 μg／mL 的混合储备液；移取蔗糖和麦芽糖单一标准储备液各 1 mL 于 1 只 100 mL容量瓶中，用体积浓度为 50% 的乙腈定容至标线，配制成蔗糖和麦芽糖的质量浓度均为 10 μg／mL的混合储备液，于 4℃保存，备用。

分别移取上述两种混合储备液 0.25，0.5，1.0，1.5 ，2.0，2.5，3.0 mL 于 1 只 10 mL 容 量 瓶 中，用50% 乙腈定容至标线，配制成葡萄糖和果糖的质量浓度均为 2.5，5，10，15，20，25，30 μg／mL，麦芽糖和蔗糖的质量浓度均为 0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μg／mL 的 4 种水溶性糖的系列混合标准工作溶液。

1.3 样品处理

取出烟支中的烟丝，用旋风磨粉碎，过 850 μm筛，即得烟末样品。称取 25 mg 烟末于 50 mL 离心管中，加入 25 mL 水，超声提取 30 min，取 1.5 mL 萃取液以 12 000 r／m 离心 5 min，移取上清液 1 mL，用 50% 乙腈稀释至 10 倍体积，待测。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱条件

  色 谱 柱：[**]cquity BEH [**]mide 柱 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司 ) ；流动相：[**] 相为水，B 相为乙腈，两相均加入 0.1% 体积的氨水；流量：0.15 mL／min ；柱温：30℃；进样体积：2 μL ；梯度洗脱程序见表 1。

 1.4.2 质谱条件

  质谱电离方式：负离子模式；监测方式：多反应监测 (MRM) ；喷雾电压：3 000 V ；雾化气流量：750 L／h ；辅助气流量：50 L／h ；离子源温度：120℃。4 种水溶性糖的质谱参数见表 2。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法的选择

  烟草中水溶性糖的提取一般采用的提取液有纯 水、50% 乙 腈溶液、55%乙腈溶液、70% 乙腈溶液和 5% 的乙醇溶液。以纯水超声提取即可满足检测要求，既简便又节约了有机溶剂。烟草中水溶性糖含量较高，多倍稀释后可有效减小基质效应，因此样品采用纯水超声 30 min，萃取液稀释 10 倍后直接进样分析。

2.2 质谱条件的优化

通过质谱外接针泵，采用流动注射方式，以 20μL／min 将 1.0 μg／mL 4 种水溶性糖的单一标准溶液分别注入质谱检测器中，在电喷雾负离子模式下，以每种糖的分子离子峰为母离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高的 2 个碎片离子作为特征离子，以强度最大的作为定量离子，另外一对作为辅助定性离子，然后对每种糖的定量离子和定性离子的锥孔电压和碰撞能量等质谱参数进行优化，使定量离子与定性离子的离子对强度达到最大，从而得到每种糖的最佳质谱检测参数见表 2。

2.3 色谱条件的优化

  在相同的梯度洗脱条件下，比较了甲醇和乙腈的分离效果，结果表明，使用甲醇 – 水为流动相洗脱时，4 种水溶性糖的保留时间较短，色谱峰形较好，但葡萄糖与果糖、蔗糖与麦芽糖难以实现基线分离。由于这两组糖的组分互为同分异构体，有相同的母离子和子离子，所以分离难度较大。使用乙腈 – 水为流动相洗脱，4 种糖可达到基线分离。降低水相初始比例则出峰推迟，葡萄糖、麦芽糖出现严重的峰分叉；降低流量有利于消除葡萄糖、麦芽糖峰分叉。由于葡萄糖、麦芽糖等还原性糖会产生旋光异构，这些异构体在有些色谱条件下会被分离，这种现象在酸性或自然条件下较易出现。向流动相中加入碱性调节剂后，糖的旋光异构会消失，并且糖带有多羟基，在碱性条件下易于离子化，在流动相中加入0.1% 的氨水后，4 种水溶性糖的色谱图见图 1。由图 1 可知，各组分色谱峰形对称，分离度较好。

2.4 线性方程与检出限

  在 1.4 仪器工作条件下对 4 种水溶性糖的系列混合标准工作溶液进行测定，以各组分的质量浓度为横坐标（x），色谱峰面积为纵坐标（y）绘制标准工作曲线。根据最小检测浓度的 3 倍相对标准偏差、前处理的样品质量、提取体积和稀释倍数等计算方法检出限。4 种水溶性糖的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表 3。由表 3 可知，4 种水溶性糖的质量浓度在各自的线性范围内（葡萄糖和果糖的线质量浓度为 2.5～30 μg／mL，麦芽糖和蔗糖的质量浓度为 0.25～3 μg／mL）与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于 0.997，方法检出限为 0.03 mg／g，满足分析要求。

2.5 精密度试验

  取已知 4 种水溶性糖含量的样品，按照 1.3 方法处理，在 1.4 仪器工作条件下平行测定 6 次，测定结果见表 4。由表 4 可知，测定结果的相对标准偏差为 0.7%～2.9%，表明该方法的精密度较高。

2.6 加标回收试验

  取已知 4 种水溶性糖含量的样品，分别进行低、中、高 3 个水平的加标，在 1.4 仪器工作条件下平行测定 6 次，测定结果见表 5。

由表 5 可知，在 3 个添加水平上，样品的平均回收率为 93.6%～101.0%，说明该方法的准确度较高。

2.7 实际样品测定

采用所建方法测定了 40 份云产卷烟样品中4 种水溶性糖的含量，含量均值由高到低依次为果糖 (119.9 mg／g)、葡萄糖 (79.5 mg／g)、麦芽糖 (15.2 mg／g)、蔗糖 (13.2 mg／g) ；变异系数由高到低依次为蔗糖 (19.4%)、麦芽糖 (19.0%)、葡萄糖 (17.4%)、果糖 (10.5%)。根据 4 种水溶性糖含量进行聚类分析，40 份卷烟样品可聚为 4 类（见表 6）。1 类样品主要是部分云系品牌低端卷烟产品，表现为葡萄糖、果糖含量在 4 个类别中最低；2 类样品是大部分云产中端产品，表现为葡萄糖和蔗糖含量相对稍高；3 类样品是云系品牌在省外生产的卷烟产品，表现为麦芽糖和蔗糖含量最高；4 类样品是云系品牌中高端卷烟产品，表现为葡萄糖和果糖含量最高。由表 6 可知，各类果糖含量均有显著差异；葡萄糖含量除 2类与 3 类之间没有差异外，其余各类之间均存在显著差异；蔗糖和麦芽糖含量在各类之间差异相对较小或无显著差异。总体来看各类别之间果糖差异较大，其次葡萄糖、再次麦芽糖，蔗糖差异最小。

 3 结语

  建立了超高效液相色谱 – 串联质谱法测定卷烟中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖 4 种水溶性糖的含量。该方法取样量少，样品处理简单，分析速度快，具有较高的实用参考价值。