1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)首次将朗伯–比耳定律应用于定量分析化学领域，由此诞生了第一台比色计。1918年，美国国家标准局制造出了世界上第一台紫外可见分光光度计。时至今日，紫外可见分光光度计在分光元器件、仪器控制模块、记录与绘图设备、检测器、仪器构型等方面已经历了多次更新换代，仪器的性能不断提高，并且更加智能化、高速化、小型化。虽然紫外可见分光光度计的应用已有近百年的历史，但是由于其具有灵敏度高、选择性好、操作简便、适用范围广等特点，因此仍然是目前应用最广泛的分析仪器之一。在化工、食品、生物医药、环境监测、第三方检测等领域的分析实验室中都离不开紫外可见分光光度计。

    对于紫外可见分光光度计的计量检定，国家有相应的检定规程JJG178–2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》。该检定规程所涉及透射比的计量中，检定点为10%，20%，30%，按照朗伯–比耳定律换算成吸光度为1.000，0.699，0.523三点，所覆盖的测量范围有限。而随着紫外可见分光光度计的迅猛发展，目前市场上紫外可见分光光度计的吸光度测量范围甚至可达到8.000，远超过检定规程中所涉及的范围，有不少客户提出了检定规程覆盖范围之外的校准需求。线性范围是紫外可见分光光度计性能高低的重要指标，在该范围内仪器的吸光度响应值与被测物浓度的线性关系良好，超出该范围后则线性变差。因此为了判别紫外可见分光光度计在整个吸光度测量范围内的性能，笔者通过实验对紫外可见分光光度计线性范围的校准进行研究，提出了相应的校准方法与技术指标。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

   紫外可见分光光度计：Lambda25型，美国铂金埃尔默公司；

   重铬酸钾纯度标准物质：编号为GBW(E)060018i，纯度标准值为99.96%，扩展不确定度U=0.02%(k=2)，中国计量科学研究院；

   硫酸：分析纯，稀释至0.005mol／L的硫酸溶液使用，北京盈祥科技有限公司。

1.2实验环境条件

   参照JJG178–2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中的环境要求，在温度10～35℃、相对湿度不大于85%的环境下进行实验。

1.3标准溶液的配制

   取适量的重铬酸钾纯度标准物质，用0.005mol／L的硫酸溶液配制成重铬酸钾质量浓度分别为0.024，0.048，0.072，0.096，0.120，0.144，0.168，0.192，0.216，0.240，0.264，0.288，0.312，0.336，0.360mg／mL的系列标准溶液。

1.4实验方法

   参照美国食品药品监督管理局(FD[**])对紫外可见分光光度计的仪器认证中吸光度的测量，选用重铬酸钾作为线性范围测量的纯度标准物质，用紫外可见分光光度计按照浓度由低到高的顺序测量重铬酸钾系列标准溶液的吸光度，测量波长为与检定规程相同的4个波长，即235，257，313，350nm。由此便可得到4个波长下不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度。以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标进行线性拟合，得到这4个波长下的线性数据。参照JJG705–2014《液相色谱仪检定规程》中紫外–可见光检测器和二极管阵列检测器的线性范围的测量，以线性在高浓度下开始发生偏离的浓度点作为线性范围的上限，以最小检测浓度作为线性范围的下限。

2结果与讨论

2.1吸光度的测量

   按1.4实验方法测得的4个波长下不同浓度重铬酸钾溶液的吸光度见表1。

2.2测量波长的确定和线性范围上限的测量

   将表1中每个波长的数据分别以重铬酸钾溶液液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标进行线性拟合，如图1～图4所示。

   由图1～图4可以看出，波长313nm时重铬酸钾溶液的吸光度值较低，并且仍然呈现较好的线性，其它3个波长条件下，在重铬酸钾溶液浓度较低时呈现良好的线性，而在浓度较高时曲线趋于平缓，线性明显变差，表明已超出了线性范围的上限。因此可以确定线性范围上限的具体浓度点就在这个浓度范围之内。将4个监测波长下各个浓度范围的线性相关系数列于表2。由表2可知，313nm波长条件下的线性相关系数直至重铬酸钾溶液浓度达到0.360mg／mL时依然保持在0.999以上，这是因为重铬酸钾溶液在波长313nm时的吸光度较小，即便浓度达到0.360mg／mL时其吸光度也只有1.7103(见表1)，远小于其它3个波长条件下测得的吸光度。若想得到313nm波长条件下线性范围的上限，还需要将重铬酸钾溶液浓度继续递增。因此对于线性范围的计量校准而言，313nm波长条件下吸光度随浓度变化缓慢，灵敏度较低，不适合作为线性范围计量校准的波长。

   以各个浓度范围的最大浓度为横坐标，以各个浓度范围的线性相关系数r为纵坐标绘制曲线，结果如图5所示。由图5可以看出，波长分别为235，257，350nm时的线性相关系数均随浓度范围的扩大而明显降低，其中波长257nm时的下降趋势最为显著，也就是说波长257nm用于线性范围计量校准的灵敏度高。依照紫外可见分光光度计的一般使用要求，当线性相关系数大于0.997时认为线性良好。而由表2可知，波长257nm条件下，当重铬酸钾溶液浓度达到0.240mg／mL时线性相关系数开始低于0.997。而波长235nm和350nm条件下，线性相关系数开始低于0.997时的重铬酸钾溶液浓度均为0.288mg／mL，大于257nm条件下的对应浓度(0.240mg／mL)，也证明了波长257nm条件下线性范围校准的灵敏度高，因此选用257nm作为紫外可见分光光度计线性范围计量校准的波长。该台紫外可见分光光度计的线性范围上限即为257nm条件下线性相关系数开始低于0.997之前的那个浓度，即0.216mg／mL。

2.3线性范围下限的测量和线性范围的确定

   线性范围下限为该台紫外可见分光光度计的最小检测浓度。参照JJG694–2009《原子吸收分光光度计检定规程》，以噪声的标准偏差的3倍量值为基础，采用如下方法进行紫外可见分光光度计最小检测浓度的测量。

   在1.2实验环境条件下，选用波长257nm，连续测量11次空白溶液(0.005mol／L的硫酸溶液)的吸光度，计算得到11次测定结果的标准偏差s为0.000040。再将线性未发生偏离时的浓度范围0.024～0.216mg／mL进行线性拟合，以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到拟合方程y=13.612x+0.082，其斜率k为13.612。则最小检测浓度也就是线性范围下限C_L=3s／k=8.82×10^–6mg／mL。

   结合2.2中得到的线性范围上限，该台紫外可见分光光度计的线性范围为8.82×10^–6～0.216mg／mL。

3紫外可见分光光度计线性范围校准方法的确定

   根据上述实验研究提出如下紫外可见分光光度计线性范围的校准方法。

3.1校准环境条件

   温度10～35℃，相对湿度不大于85%。

3.2标准物质

   重铬酸钾纯度标准物质：编号为GBW(E)060018i，纯度标准值为99.96%，扩展不确定度U=0.02%(k=2)。

3.3校准方法

   按1.3方法配制重铬酸钾系列标准溶液，在波长257nm条件下，用0.005mol／L硫酸溶液进行吸光度调零，然后按照浓度从低到高的顺序测定重铬酸钾系列标准溶液的吸光度。以前4个浓度点为首个浓度范围，即0.024～0.096mg／mL，再以重铬酸钾溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标的进行线性拟合，得到相应的线性相关系数。以此类推，分别对前5个浓度点、前6个浓度点、前7个浓度点……进行线性拟合，得到对应的线性相关系数，直至线性相关系数低于0.997为止。取线性相关系数低于0.997时的前一个浓度点为该台紫外可见分光光度计的线性范围上限C_H。

   在相同条件下，连续测量11次空白溶液的吸光度，按式(1)、式(2)计算该台紫外可见分光光度计的线性范围下限C_L。

式中：s——11次空白吸光度测量值的标准偏差；

   [**]_i——第i次的吸光度测量值；

   [**]——11次空白吸光度测量值的平均值；

   n——测量次数，n=11；

   C_L——线性范围下限；

   k——线性范围上限校准时所得到的拟合直线的斜率。

3.4技术指标

   参照JJG178–2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中的吸光度覆盖范围与仪器噪声要求，结合线性范围上限与下限的校准方法，紫外可见分光光度计的线性范围下限应不大于1.0×10^–3mg／mL，上限应不小于0.10mg／mL。

4结语

   针对紫外可见分光度计线性范围的计量校准进行了实验研究与讨论，提出了紫外可见分光度计线性范围的校准方法与技术指标，覆盖了JJG178–2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》中没有覆盖的吸光度范围，能够实现紫外可见分光度计全范围吸光度的计量校准。