大肠菌群平板计数法原理及检验时应注意的事项

       本法参照国标GB 4789. 3-2010规定的大肠菌群测定方法第二法。

      ⒈检验程序见图3-7

       ⒉原理

       样品先经过VRB[**]琼脂平板的筛选，因其中含有胆盐和结晶紫，可以很好的抑制革兰氏阳性菌的生长，乳糖可以产酸，在中性红存在时，产生典型的紫红色周围有红色胆盐沉淀的菌落。因为其他阴性肠杆菌可以分解其他糖类产生红色菌落，因此需接种BGLB培养基证实。

       ⒊操作步骤

       样品处理及稀释同MPN法。

       ①加样制作平板：选取2-3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿ImL。同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15 -20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRB[**]）倾注．于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3～ 4mL VRB[**]覆盖平板表层。翻转平板，置于（36±1)0C培养18~24h.

       ②平板菌落数的选择：选取菌落数在15 ~150CFU的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0. 5mm或更大。

       ③证实试验：从VRB[**]平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，(36±1)℃培养24-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

       ④大肠菌群平板计数的报告：经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8. 3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（每毫升）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL，在VRB[**]平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100 X 6/10 X 10-4 CFU/g(mL)＝6. 0 X 10一3 CFU/g（mL)。

       ⒋检验时应注意的事项

       ①检验步骤

       2008版前的大肠菌群的检验步骤采用三步法（乳糖胆盐发酵试验、EMB琼脂分离培养和证实试验）。第一步乳糖发酵实验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经过平板分离和证实试验后，有时可以成为阴性。大量的数据表明，食品中大肠菌群检验步序的符合率，初发酵与证实试验相差较大，不同食品三步法的符合情况也不一致，所以2008版之后改为两步法，取消了分离培养这一步，将大肠菌群MPN计数法的培养基由乳糖胆盐修改为月桂基硫酸盐胰蛋白膝肉汤；复发酵培养基由乳糖发酵肉汤改为亮绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤，大肠菌群MPN法中报告每100mL (100g）改为1mL(1g)。试验证实，修改后对大肠菌群的检出效果相同，发酵管对于阳性结果的判断只通过“产气”，不存在颜色的影响，明确了判断依据；减少了步骤，使操作更加简便，结果更接近真实。

       ②产酸产气原因：在初发酵试验中，能出现产酸产气现象的原因很多，如大肠菌群发酵乳糖产酸产气；两种细菌共同作用发酵乳糖产酸产气，但其中任何一种不能单独发酵；食品中杂菌多时，（多黏芽抱杆菌、浸麻芽抱杆菌、产气荚膜梭菌）发酵乳糖产酸产气；有些非大肠菌群发酵葡萄糖等糖类产酸产气。因此必须做证实试验。

       ③复发酵结果：从LST产气管接一环到BGLB中进行复发酵，（此时不受样品中非乳糖的干扰进行乳糖发酵，也避免了许多芽抱杆菌的干扰），在BGLB中产气的为阳性，不产气的为阴性。但此法也有缺陷，有时出现假阳性。由于亮绿遇胆盐降低了其活性，有时不能彻底抑制芽抱菌。为避免此缺陷，对BGLB中产气的划线于EMB上，挑典型菌落镜检。

       ④抑菌剂：在大肠菌群检验中，经常使用的抑菌剂有胆盐、洗衣粉、十二烷基磺酸钠、亮绿、结晶紫、孔雀绿等。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响；有的抑菌剂当牌号、规格改变时，也可影响抑菌效果，而需重新测定抑菌的有效剂量，这些情况均给抑菌剂的使用带来不利条件。目前我国在食品大肠菌群检验方面采用胆盐作为抑菌剂，猪、牛、羊三种胆盐对大肠菌群的检验效果，经试验观察无明显差异，可相互替代，但其他胆盐的检验效果则不一致，故不宜相互替代。

       目前由于胆盐不易购买，有的实验室以3号胆盐、混合胆盐、去氧胆酸钠、兔胆盐等替代猪胆盐加入培养基中，这会影响大肠菌群的检验结果，应予注意。因此在2008版的检验标准中改为月桂基硫酸钠。两者的作用都是抑制革兰氏阳性球菌。但前者是化学试剂，批间差异小，易观察结果，对损伤菌有修复作用，检出率提高，检验结果稳定。后者是生物试剂，取自牛和猪等动物的胆囊，批间差异大，结果可靠性差。另外，在胆盐用量上实验表明1%, 0.5％和0. 25％三个剂量无任何差异，所以目前乳糖发酵管采用的胆盐剂量（(0. 5%)是适宜的，在称量时稍有误差，亦不致影响大肠菌群的检出。

       ⑤平板计数法：若样品较脏，使用MPN法较不方便，一般使用结晶紫中性红胆盐琼脂（VRB[**]）在平皿内样品稀释液与VRB[**]琼脂混合，等到凝固后，另加盖一层VRB[**]琼脂，以抑制专性需氧菌，从中挑取粉红晕的菌落计数，取30~150个菌落的平板，挑选其中10个有代表性的菌落分别接种到亮绿胆盐发酵管进行鉴定。

       ⑥挑选菌落：大肠菌群是一群肠道杆菌的总称，大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠埃希氏菌类更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。所以在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在检验中，大肠菌群在VRB[**]琼脂上典型菌落呈紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0. 5mm或更大。在伊红一美蓝（EMB)平板上的菌落呈黑紫色有光泽或无光泽的检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。菌落形态的其他方面（如菌落大小、光滑与粗糙、边缘完整情况、降起度、湿润与干燥等）虽亦应注意，但不如色泽方面更为重要。影响大肠菌群检出率的因素较多，如食品种类、菌落色择和形态、细菌种类等，所以实际工作中通常挑选一个菌落，由于概率问题，难免出现假阴性，尤其当菌落不典型时。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则多挑几个，以免出假阴性。

       ⑦产气量：大肠菌群的产气量，多者可使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而不同，有小于米粒的气泡，亦可有阳性检出。对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应做进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。

       ⑧MPN法：MPN法是一种采用数学理论推算，用置信区间描述细菌浓度的一种间接计数法。虽然实验结果以MPN值表示，但MPN值并不能表示实际菌落数，而实际菌落数落在置信区间内的任何一点。该方法是1915年McCrady首次发表的。

       最可能数（MPN）是表示样品中活菌密度的估测。MPN检索表通常是采用三个稀释度九管法来计算的，当然也可以十五管或更多。稀释度的选择是基于对样品中菌数的估测，较理想的结果应是最低稀释度3管为阳性，而最高稀释度的3管为阴性。如果无法估测样品中的菌数，则做一定范围的稀释度。这次提供的MPN检索表列出了95％可信限，供作参考。

       另外，在查阅MPN检索表时，应注意以下几不问题。

       通常MPN检索表只给了三个稀释度，即0.1mL(g), 0.O1mL(g), 0.OO1mL(g)，如欲改用1mL(g)、0. 1mL(g)、0. 01mL(g）或0. 01mL(g)、0. 001mL(g)、0. 0001mL(g）时，则表内数字应相应增加或降低10倍，其余可类推。

       在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的mL (g)，系指原样品（包括液体和固体）的毫升（克）数，并非样品稀释后的毫升（克）数，如固体样品lg经10倍稀释后，虽加人1mL量，但实际其中只含0. 1 g样品，故应按0. 1g计，不应按1mL计，或按1mL计，单检索数字必须再乘以稀释倍数。

       当检索表内三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN值应按＜3判定，这样更能反映实际情况。例如11. 1mL(g）和1. 11mL(g）两个检测剂量，当它们都是阴性时，如按。处理，则两组样品虽相差10倍，但MPN值却无法区分，实际上这两个。的含义并不相等。如按照＜3和＜30处理，则MPN值能反映出两组所用样品量的不同，实际上11. 1mL(g）应为G3，而1. 11mL(g）应为＜30，二者还是有区别的。所以用＜3和＜30处理，更能反映实际情况。