海洋脂类活性物质中因含有多个不饱和键，是一类具有独特生理功能类型的化合物，其中 ω–3 系列脂肪酸和 ω–6 系列脂肪酸在维持身体健康和预防疾病等方面具有重要的作用。二十碳四烯酸又称花生四烯酸 ([**]rachidonic acid，[**]R[**]) 是人体含量丰富且极其重要的 ω–6 系列多不饱和键脂肪酸，是人体必需的一种多不饱和键脂肪酸。作为性油脂，二十碳四烯酸具有广泛而重要的生理功能，如预防和治疗心血管疾病、促进生长发育、益智健脑、提高免疫力、保护皮肤、改善发质、降血糖、降血、降低血液中的胆固醇、抗炎抗癌等保健功能，同时二十碳四烯酸对婴幼儿的大脑神经系统和视网膜的功能完善具有特别重要的意义。二十碳四烯酸已在保健食品、医药、化妆品和饲料等领域得到广泛应用。

  国际上销售的二十碳四烯酸主要从深海鱼油、动物内脏中获取，微生物发酵及藻类培养生产二十碳四烯酸是新兴的两种生产方式。目前应用的二十碳四烯酸主要有甘油酯型、甲酯型和游离脂肪酸型。自上世纪 90 年代以来，应用于保健品的类型主要以甲酯型为主，但迄今为止，我国尚未发现研制二十碳四烯酸甲酯国家标准样品的报道。

  为了给国内相关高校、研究所和生产企业提供二十碳四烯酸甲酯标准样品，以解决其指导科研和生产的需求，既能创造社会效益，又能创造经济效益，笔者开展了二十碳四烯酸甲酯国家标准样品的研究。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  气相色谱仪：7890 B 型，配备 FID 检测器，美国安捷伦科技有限公司；

  傅里叶变换红外光谱仪：VERTEX 70 型，德国布鲁克公司；

  液质联用仪：Waters 3100 型，美国沃特世公司；核磁共振波谱仪：400 MHz 型，德国布鲁克公司；

  甲醇、氢氧化钾、硫酸、尿素、硝酸银、无水硫酸钠、丙酮：分析纯；

  正已烷：色谱纯；

  硅胶：层析用，77~154 μm，180℃烘干 4 h ；

  石油醚：沸程为 60~90℃；

  硝酸银 – 硅胶层析柱：25 cm×5 cm，自制；二十碳四烯酸油粗品：北京盈祥科技有限公司。

1.2 标准样品的制备与分装

1.2.1 制备

  采用甘油酯型二十碳四烯酸油粗品为原料，通过皂化反应、尿素包合分离、甲酯化、分子蒸馏、硅胶 – 硝酸银柱层析分离提纯、残余溶剂去除等过程，获得高纯二十碳四烯酸甲酯单体。

  以经过柱层析分离提纯的二十碳四烯酸甲酯粗品作为原料，采用 SB–C₁₈(250 mm×20 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司 ) 半制备色谱柱，采用制备液相色谱技术精制，收集纯度高于 99% 的馏分片段，于 40℃水浴中旋转浓缩至溶剂挥干，再经高真空泵石油醚三级油扩散泵蒸干，即可得到纯度高于99% 的二十碳四烯酸甲酯。

1.2.2 分装

  在洁净实验室，对二十碳四烯酸甲酯样品进行分装与封装。用 1 mL 棕色安瓿瓶进行充氮保护分装，每瓶 50 μL，用自动分液器分装，高温封口，共100 瓶，分别编号为 1^#~100^#。分装完毕后，样品置于 –18℃冰箱中保存。

1.3 结构确证

  采用红外、质谱、核磁对二十碳四烯酸甲酯标准样品进行结构确证。

1.3.1 红外分析条件

  采 用 KBr 压 片 液 膜 法；波 数 范 围：7 500～370 cm^–1 ；分辨率：0.4 cm^–1。

1.3.2 质谱分析条件

  电离源：[**]PI ；毛细管电压：3.5 KV ；电离源温度：120℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂氮气流量：500 L／h ；锥孔氮气流量：50 L／h。

1.3.3 核磁分析条件

溶剂：氘代氯仿；采集 ¹H–NMR 谱和 ¹³C–NMR谱图。

1.4 气相色谱条件

色谱柱：聚乙二醇类 HP–FF[**]P 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司 ) ；柱流量：1.0 mL／min ；进样体积：1 μL ；进样口温度：260℃；升温程序：以 100℃为初始温度，保持 5 min，以 5℃／min 升至 220℃，保持 20 min ；载气：高纯氮，流量为 1 mL／min ；尾吹气流量：30 mL／min ；燃 烧 气：氢 气，流 量 为 40 mL／min ；助燃气：空气，流量为 400 mL／min ；检测器：FID ；检测器温度：270℃；进样方式：分流进样，分流比为10∶1。

1.5 纯度分析

  配制二十碳四烯酸甲酯样品溶液的质量浓度为 1.0 mg／mL，采用气相色谱法、峰面积归一法等对二十碳四烯酸甲酯进行纯度分析。

1.6 均匀性、稳定性、定值研究

根据 GB／T 15000.3–2008《标准样品工作导则(3) 标准样品 定值的一般原则和统计方法》

的指导，对国家标准样品的稳定性、均匀性及定值检测进行研究。

1.6.1 均匀性考察

  通过随机挑选重复测量的方法，并采用单因素多水平试验方差分析法进行纯度均匀性检验。

1.6.2 稳定性考察

  将二十碳四烯酸甲酯标准样品于 –18℃条件下放置 24 个月，对其进行长期稳定性研究。分别于不同时间取样检测，采用直线方程作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，预测二十碳四烯酸甲酯样品的稳定性。

1.6.3 定值分析

  选择 8 家定值实验室，用气相色谱峰面积归一法对二十碳四烯酸甲酯进行联合定值。气相色谱分析条件同 1.4 方法。分别随机取 3 个样品进行送检，每个样品平行测试 2 次，对 8 家实验室的 6 个数据进行统计，计算得出二十碳四烯酸甲酯标准样品的标准值和不确定度。

2 结果与讨论

2.1 结构确认

  分别采用红外、质谱和核磁等方法对二十碳四烯酸甲酯进行结构鉴定。

2.1.1 红外光谱分析

  二十碳四烯酸甲酯的红外光谱数据见表 1。由表 1 可知，样品的红外光谱数据说明结构中存在酯键 (–CO–O–)，CH₃，CH₂ 和顺式烯烃 (–HC=CH–)

等基团。

 2.1.2 高分辨质谱分析

  二十碳四烯酸甲酯加氢离子 (C₂₁H₃₄O₂H₊) 的理论精确质量数为 319.263 1，高分辨质谱测得的二十碳四烯酸甲酯加氢离子精确质量数为 319.262 7，两者数据基本一致。

2.1.3 核磁共振分析

二十碳四烯酸甲酯的化学结构式如图 1 所示。

样品的核磁共振谱图 (1H NMR，13C NMR 等 )所给出的结构信息见表 2。由表 2 可知，二十碳四烯酸甲酯的核磁共振数据与图 1 所示的二十碳四烯酸甲酯的化学结构式相符，因此确定该样品为二十碳四烯酸甲酯。

2.2 样品制备及分离纯化

二十碳四烯酸甲酯单体的制备液相色谱图见图 2，气相色谱图见图 3。

 由图 2、图 3 可知，该法分离度良好，与杂质都能完全达到基线分离，保留时间合理，峰形美观对称，气相色谱法适用于定量分析，可作为定值检测的方法。

2.3 纯度分析

  在 1.4 气相色谱条件下测定二十碳四烯酸甲酯的系列标准工作溶液，以其质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准工作曲线，得线性回归方程为 y = 1.659 6x– 0.366 4，线性相关系数

r = 0.999 9，表明二十碳四烯酸甲酯的质量浓度在10.2~510.0 μg／mL 范围内与峰面积的线性关系良好。逐级稀释溶液测定检出限、定量限，以 3 倍的信噪比（S／N）得二十碳四烯酸甲酯的检出限为 0.05 ng，以 10 倍的信噪比得二十碳四烯酸甲酯的定量限为 0.14 ng。

  在 1.4 气相色谱条件下，按照 1.5 方法对标准样品进行纯度分析，得二十碳四烯酸甲酯纯度为99.28%。平均加标回收率为 103.17%，测定结果的相对标准偏差为 0.85%，表明该法准确度和精密度较高。

2.4 均匀性检验

依据 GB／T 15000.3–2008《标准样品工作导则(3) 标准样品 定值的一般原则和统计方法》中“随机抽取的最小瓶数在 10 和 30 之间，而且一般不应少于 10”规定，确定抽样数量为 15 个，采用方差分析法对二十碳四烯酸甲酯标准样品的纯度进行均匀性检验，每个样品重复测定 3 次，以峰面积百分比记录样品的纯度。对纯度数据用方差分析法进行分析，以 F 值检验，检验结果见表 3、表 4。

 统计量 F =MS _组间／MS _组内 = 0.000 220／0.000 213 = 1.04 ，查表可知F_{(0.05，14，30)}=2.04， F ＜ F_{(0.05，14，30)}，说明在 95% 的置信区间，二十碳四烯酸甲酯样品均匀 性良好。 

 2.5 稳定性检验

分别于 0，6，12，18，24 个月的月末抽取样品，在1.4 色谱条件下对每个样品平行测定 3 次，以峰面积百分比记录样品的纯度，考察样品的稳定性。依据GB／T 15000.3–2008［9］的要求，采用直线方程作为经验模型，对二十碳四烯酸甲酯标准样品长期稳定性获得的数据进行分析，结果见表 5。

根据表 5 中的实验数据进行计算得以下参数：

     斜率 b₁= – 0.001 000 ；

     截距 b₀ = 99.186 ；

     直线上点的标准偏差 s = 0.017 416% ；

     与斜率相关的不确定度 s(b₁) = 0.001 836 ；自 由 度 为 n–2 和 P=0.95 (95% 置 信 水 平 ) 的 t分布 t_0.95,_n–2 = 4.303。

         t_0.95,_n–2s(b₁) = 0.007 900

  由于 |b₁| ＜ t_0.95,_n–2s(b₁)，故斜率不显著，未观测到不稳定性。长期试验稳定性的不确定度贡献度u_lts=0.02%。经长期稳定性试验，二十碳四烯酸甲酯标准样品在低温密闭环境下纯度基本稳定，说明二十碳四烯酸甲酯标准样品于 –18℃条件下保存 12个月的稳定性良好。

2.6 定值结果及其不确定度评定

2.6.1 定值结果

依据 GB／T 15000.3–2008《标准样品工作导则(3) 标准样品 定值的一般原则和统计方法》，结合实际条件，采用多家实验室协作试验定值的方式对二十碳四烯酸甲酯标准样品进行定值，确定参加定值分析的实验室为 8 家，每家实验室均采用相同的标准操作程序，均从全部样品中随机抽取 3 个样品，采用气相色谱法对样品进行纯度检测，每个样品独立测定 2 次，共得到 6 个数据，对于相对标准偏差超过 1.5% 的实验室数据结果将不予接受，定值结果见表 6。

 由表 6 数据计算得二十碳四烯酸甲酯标准样品的定值结果为 99.28%。

2.6.2 定值结果的不确定度评定

  采用格拉布斯（Grubbs）检验法对二十碳四烯酸甲酯的定值结果进行检验，测定结果呈正态分布。根据 GB／T 15000.3–2008规定，定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度由标准值定值试验的不确定度、均匀性检验的不确定度和稳定性检验的不确定度组成。

（1）标准值定值试验的不确定度：U_char=0.06%

（2）均匀性检验的不确定度：U_bb=0.02%

（3）稳定性检验的不确定度：U_lts=0.02%

二十碳四烯酸甲酯标准样品定值结果的不确定度：

取包含因子 k=2，则扩展不确定度：

U₉₅=ku=2×0.07%=0.14% 

通过上述统计学数据处理，二十碳四烯酸甲酯标准样品的特性值定值结果为 99.28%±0.14%（置信度为 95%，k=2）。

3 结语

  依据 GB／T 15000.3–2008 研制了二十碳四烯酸甲酯标准样品，根据标准样品研制流程对其进行了稳定性和均匀性检验以及定值检测研究。二十碳四烯酸甲酯标准样品的定值结果为 99.28%±0.14%（置信度为 95%，k=2），最终通过国家标样委员会评审，成为国家标准样品。研制的二十碳四烯酸甲酯标准样品填补了国内该领域研究的空白，可以提供给国内相关高校、研究所和生产企业，用以指导科研和生产的需求，既能够创造社会效益，又能够创造经济效益。