蛋白质含量测定方法
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
一、原理:
考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合,在595nm下测定的吸光度值[**]595,与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDT[**]等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
二、试剂与器材1.试剂:(1)标准蛋白质溶液,用球蛋白或牛血清清蛋白(BS[**]),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀释至1升。2.器材:(1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支
三、操作方法
1.标准方法
(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
(2)加完试剂2~5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值[**]595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlG-250试剂。注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值[**]595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的[**]595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的[**]595约为0.50。2.微量法当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml),可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O,考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线,测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的[**]595约为0.29。
Folin—酚试剂法(Lowry法)
一、实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸钠(1%),硝酸钠(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时,加Folin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
二、试剂与器材
1.试剂
(1)试剂甲:
([**])10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。
(B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份([**])与1份(B)混合,即为试剂甲。
(2)试剂乙:
在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。
(3)标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9 % NaCl溶液。
2.器材
(1)可见光分光光度计
(2)旋涡混合器
(3)秒表
(4)试管16支
三、操作方法
1.标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂),同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时,为了防止出错,必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。
2.样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。
二喹啉甲酸法(BC[**]法)
一、实验原理
BC[**]检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比,BC[**]法的操作更简单,试剂更加稳定,几乎没有干扰物质的影响,灵敏度更高(微量检测可达到0.5μg/ml),应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物,同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物,在碱性条件下,可以和Cu+结合生成深紫色的化合物,这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值,并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。
二、实验材料
1.实验器材 721分光光度计;恒温水浴槽;移液管;微量进样器;试管架和试管。
2.实验试剂
(1) BC[**]试剂的配制
① 试剂[**],1L:分别称取10g BC[**] (1%),20g Na2CO3·H2O (2%),1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%),4g NaOH (0.4%) ,9.5g NaHCO3 (0.95) ,加水至1L,用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。
② 试剂B,50ml:取2g CuSO4·5H2O (4%),加蒸馏水至50ml。
③ BC[**]试剂:取50份试剂[**]与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。
(2)标准蛋白质溶液:称取40mg牛血清白蛋白,溶于蒸馏水中并定容至100ml,制成400μg/ml的溶液。
(3)样品溶液:配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。
三、实验操作
1.绘制标准曲线 标准曲线的绘制:取试管七支、编号,按下表操作:
试剂 | 管号 | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 空白管 | 测定管 | |
蛋白质标准液(ul)(1.5mg/ml) | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | ||
双蒸水(ul) | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 | 100 | |
待测样品(ul) | 100 | ||||||
BC[**]工作液(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
混匀,37℃保温30min,用562nm比色,测定吸光度值
2.实验结果 根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。
四、该方法的优点
(一) 操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便;
(二) 准确灵敏,试剂稳定性好,BC[**]试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml,微量BC[**]测定范围在0.5-10μg/ml。
(三) 经济实用,除试管外,测定可在微板孔中就进行,大大节约样品和试剂用量;
(四) 抗试剂干扰能力比较强,如去垢剂,尿素等均无影响 。
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