芝麻油是人们日常生活中经常食用的一种调味品，它含有丰富的维生素和人体必需的不饱和脂肪酸、氨基酸以及铁、锌、铜等微量元素，深受人们喜爱，是食用油中之珍品。为防止芝麻油发生氧化，延长货架期，人们常在芝麻油中添加抗氧剂。在有效浓度内抗氧剂能起到很好的抗氧化作用，但当使用过量时，会对人体产生一定的危害。叔丁基羟基茴香醚(BH[**])、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、特丁基对苯二酚(TBHQ)是芝麻油常用的3类合成酚类抗氧剂，其中BH[**]具有潜在的致癌性，能抑制人体呼吸酶活性。GB2760–2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对芝麻油中这3类抗氧剂均有限量要求，规定其含量均不大于0.2g／kg。

   目前食用油中BH[**]，BHT，TBHQ的测定方法主要有电分析法、比色法、气相色谱法、气相色谱–质谱联用法、高效液相色谱法、液相色谱–质谱联用法等，其样品处理主要采用有机溶剂萃取法和凝胶渗透色谱仪净化处理法。凝胶渗透色谱仪价格昂贵，处理过程复杂，试剂用量大，样品回收率不高。采用GB5009.32–2016《食品安全国家标准　食品中9种抗氧化剂的测定》方法进行测定时，要消耗大量有机试剂进行提取净化处理，操作过程繁琐，乙腈毒性较大，且在BHT出峰处出现一个很大的倒峰，影响BHT的出峰。采用NY／T1602–2008《植物油中BH[**]，BHT和TBHQ的测定　高效液相色谱法》测定时，乙酸对BHT的峰有干扰，目标峰分离效果较差。笔者重复使用5mL甲醇涡旋超声提取5次，并对梯度洗脱条件进行优化，建立了高效液相色谱法测定芝麻油中BH[**]，BHT，TBHQ的含量。该方法简化了前处理步骤，提高了提取效率，适用于芝麻油中BH[**]，BHT，TBHQ的日常检测，解决了国家标准方法应用过程中存在的问题。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

   高效液相色谱仪：Ultimate3000型，配二极管阵列检测器，美国热电公司；

   微型旋涡混合仪：XW–80[**]型，北京盈祥科技有限公司；

   电子天平：XP205型，感量为0.01mg，北京盈祥科技有限公司；

   数控超声清洗器：KQ5200DE型，北京盈祥科技有限公司；

   低速台式自动平衡离心机：DT5–2型，转速不低于4000r／min，北京盈祥科技有限公司；

   超纯水机：艾柯Exceed–Cc系列，北京盈祥科技有限公司；

   BH[**]标准品：纯度不小于98.8%，德国Dr.Ehren-storferGmbH公司；

   BHT准品：纯度不小于99.5%，德国Dr.Ehren-storferGmbH公司；

   TBHQ准品：纯度不小于99.3%，德国Dr.Ehren-storferGmbH公司；

   甲醇、乙酸：色谱纯；

   实验室用水为超纯水。

1.2标准溶液配制

   BH[**]，BHT，TBHQ标准储备液：质量浓度均为1000mg／L，分别称取BH[**]，BHT，TBHQ标准品各0.1g(精确至0.1mg)置于3只100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至标线，摇匀。

   系列混合标准工作溶液：分别吸取上述3种标准储备液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0mL于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至标线，配制成质量浓度分别为20，50，100，200，300mg／L的系列混合标准工作溶液。

1.3仪器工作条件

   色谱柱：LaChromC18柱(250mm×4.6mm，5μm，日本日立公司)；流动相[**]：0.5%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：0～5min流动相[**](50%)，5～15min流动相[**]从50%降至20%，15～20min流动相[**](20%)，20～28min流动相[**]从20%降至10%，28～30min流动相[**]从10%增至50%，30～33min，流动相[**](50%)；流量：1.0mL／min；进样体积：5μL；柱温：35℃；检测波长：280nm。

1.4样品处理

   准确称取芝麻油样品约5g(精确至0.001g)，置于15mL具塞离心管中，加入5mL甲醇，漩涡混合3min，超声5min，以4000r／min离心5min，取出上清液于25mL棕色容量瓶中，残余物再重复用5mL甲醇提取4次，上清液合并于25mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，过0.45μm滤膜，即得待测液。

2结果与讨论

2.1提取液的选择

   GB5009.32–2016中用5mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2次，合并提取液，过柱净化。NY／T1602–2008采用重复使用8mL甲醇涡旋超声提取3次。本实验采用重复使用5mL甲醇涡旋超声提取5次，测定其提取效率，并与上述两种提取方法进行比较。不同提取方法的回收率见表1。由表1可知，3种提取方法的回收率均在90%以上，且随提取次数的增多，提取效果更好，回收率更佳。但GB5009.32–2016方法试剂用量大，操作过程繁琐，且乙腈毒性较大，故选用重复使用5mL甲醇涡旋超声提取5次的提取方法。该方法既解决了试剂消耗量大，毒性大，过程繁琐等问题，又提高了提取效率，有效提取了芝麻油中的BH[**]，BHT，TBHQ。

2.2色谱条件的选择

   按NY／T1602–2008中的色谱条件对样品进行测定时，乙酸对BHT的峰有干扰，分离效果差；按GB5009.32–2016中的高效液相色谱法分析时，在BHT出峰的地方出现倒峰，影响BHT的出峰。考虑到BHT大约在20min之后出峰，故将GB5009.32–2016中梯度洗脱条件20～25min时间段改为20～28min，在该条件下3种抗氧剂混合标准溶液的色谱图如1图所示。由图1可以看出，倒峰与BHT峰得到了有效分离，且3种抗氧化剂的分离效果好，峰形较佳。

2.3线性方程及检出限

   将系列混合标准工作溶液用0.45μm有机滤膜过滤，按1.3仪器工作条件，由低浓度到高浓度依次进行测定，以待测组分的质量浓度(x)为横坐标，以其对应的色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，并计算线性方程和相关系数。另配制BH[**]，BHT，TBHQ质量浓度均为5.0mg／L的混合溶液，按1.3仪器工作条件平行测定20次，计算信噪比，以3倍信噪比对应的浓度作为方法检出限。线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。由表2可知，BH[**]，BHT，TBHQ的质量浓度在20～300mg／L浓度范围内与其色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，方法检出限为0.5～1.0mg／kg。

2.4加标回收与精密度试验

   取空白样品3份，分别添加20，50，100mg／L3个浓度水平的BH[**]，BHT，TBHQ系列混合标准工作溶液，按1.3仪器工作条件对每个样品平行测定6次，测定结果见表3。

   由表3可知，BH[**]，BHT，TBHQ的平均加标回收率为95.1%～99.8%，测定结果的相对标准偏差为2.1%～4.7%。表明该方法具有较高的准确度和精密度，符合实验室质量控制规范要求。

2.5实际样品测定

   按所建方法对本中心2018年度省级监督抽查和个人委托的芝麻油样品共计20个批次进行分析测定，测定结果显示：20个批次样品中均未检出BH[**]，BHT，TBHQ。该结果符合国家标准GB2760–2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中BH[**]，BHT，TBHQ均不超过0.2g／kg的限量规定要求。

3结语

   通过对现有标准中的前处理方法和色谱条件进行优化，建立了同时测定芝麻油中BH[**]，BHT，TBHQ含量的高效液相色谱方法。该方法操作简单，试剂用量少，准确度高，精密度好，适用于芝麻油中BH[**]，BHT，TBHQ含量的日常检测，并且解决了国家标准方法应用过程中存在的问题。