烟草中农药残留的控制是保证烟草制品吸食安全的重要手段，近年来一直是烟草行业乃至社会关注的焦点，也是国际国内贸易检验的重点。对农药残留的控制尤其是农药残留的检测技术研究对于保障烟叶质量及消费者身体健康具有重要意义。

  目前，在烟草生长过程中施用的农药主要有杀菌剂、杀虫剂、除草剂和抑芽剂。苯霜灵 (Ben)是防治卵菌纲病害的内吸性杀菌剂，也是烟草中常用的酰胺类杀菌剂，使用较为广泛。现行 Ben 的检测方法有气相色谱 – 质谱法、液相色谱法、液相色谱 – 质谱联用法和气相色谱 – 质谱联用法等。以上方法设备昂贵，检测成本高，检测周期长，需要专业人员操作，因而难以普及，无法满足企业的需要，因此研究更加简便、快捷、低成本的检测 Ben的方法尤为重要。

分子印迹电化学传感器具有高选择性和高灵敏度，制备简单，成本低廉，受 pH、温度等影响小，适合复杂体系中痕量组分如烟草及其制品中农药残留的检测，具有简便、快捷、灵敏、可靠的优点。而功能纳米材料的引入不仅可弥补印迹聚合物的缺陷，而且能显著提高传感器的灵敏度和选择性。

  笔者利用石墨烯信号放大策略，结合分子印迹技术，通过紫外引发聚合，将分子印迹膜修饰在丝网印刷电极上，获得可进行快速检测的工作电极，实现了烟草农药残留中 Ben 的快速灵敏测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  电 化 学 工 作 站：CHI660 型，采 用 三 电 极 系 统（裸／修饰石墨烯的丝网印刷电极、印迹或非印迹修饰电极为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极），上海辰华公司；

  紫外 – 可见分光光度计：UV–2401 型，日本岛津公司；

  液相色谱 – 质谱质谱联用仪：LCMS 6430 型，美国安捷伦科技有限公司；

 Ben、烯酰吗啉（Dim）、甲霜灵（Met）和氟吗啉（Flu）标准品：德国 Dr. Ehrenstorfer 公司；

  丙烯酰胺（[**]M）：分析纯，国药集团化学试剂公司；

 α- 甲基丙烯酸 (M[**][**]) ：分析纯，苏州安利化工厂；

 2- 乙 酰 氨 基 丙 烯 酸 ([**][**][**])、2- 烯 丙 巯 基 烟 酸([**]N[**]) ：分析纯，阿法埃莎 ( 天津 ) 化学有限公司；

 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (EGDM[**]) ：化学纯，使用前用乙醇重结晶纯化，上海珊瑚化工厂；

  偶氮二异丁腈（[**]IBN）：化学纯，使用前用乙醇重结晶纯化，上海试剂四厂；

  实验所用其它试剂均为分析纯；

  实验用水为去离子水 ( 电阻率为 18.25 MΩ · cm)。

1.2 实验方法

1.2.1 石墨烯及修饰电极的制备

  采用改进的 Hummer 和 Offerman 法［15］制备氧化石墨烯（GO）。取 50 mg 制备好的 GO，加入 20 mL 水混合，再加入 0.5 mL 肼。将上述混合液超声处理 1 h，置于 50℃电热板上搅拌 24 h，过滤后真空干燥，得石墨烯 (RGO)。将制得的 RGO 分散于水中，超声 1 h，得到稳定均一的悬浮液 (1 mg／mL)。

用水将丝网印刷电极（SPE）浸没，超声清洗 1h，取出后自然晾干，用循环伏安（CV）法扫描，直至出现明显 CV 峰，置于 0.05 mol／L 硫酸中进行纯化，纯化后用水洗净，晾干。取 5 µL 上述悬浮液滴涂于处理好的 SPE 上，用红外灯照射 15 min，得石墨烯修饰电极 (RGO／SPE)。

1.2.2 分子印迹膜和非印迹膜修饰电极的制备

  称取 0.012 5 mmol Ben，0.05 mmol [**]M 和 0.75 mmoL EGDM[**] 于 0.5 mL 乙腈中，超声 5 min，静置1 h，使 Ben 与 [**]M 充分结合，加入 0.24 mmol [**]IBN作为引发剂，超声直至溶解，通氮气 10 min 去除聚合底液中的氧气，得到 Ben 预聚合液。取 Ben 预聚合液 5 µL，均匀滴涂于 1.2.1 制备的 RGO／SPE 上，用波长为 365 nm 的紫外线照射 3 h，再冷却至室温，即得石墨烯修饰的 Ben 分子印迹电化学传感器（Ben- MIM／RGO／SPE）。 非 印 迹 膜 修 饰 电 极（NIM／RGO／SPE）的 制 备 除 不 加 Ben 外，其 余 步 骤 与Ben-MIM／RGO／SPE 的制备完全相同。

1.2.3 电化学检测

  以 5.0 mmol／L K3Fe(CN)6 为 探 针，0.1 mol／L KCl 为支持电解质，作为底液，将三电极系统置于底液中，稳定背景电流后，进行电化学检测［CV 和差示脉冲法（DPV）］。其中，CV 测定条件：扫描速率为 100 mV／s。DPV 测定条件：扫描速率同 CV，振幅为 0.05 V，电位增量为 0.004 V，采样宽度为 0.016s，脉冲宽度为 0.05 s。

  裸 SPE 直接测定。印迹和非印迹传感器需在测试底液中平衡 2 min 后再行测定，测定结束后用洗脱液洗脱 15 min，于 4 ℃冰箱保存待用。

1.3 烟草样品前处理

1.3.1 电分析方法

  称取 1.0 g 烟末试样于 25 mL 聚乙烯离心管中，加入 10 mL 乙腈作为萃取液，超声 10 min，过滤后加入 3 g NaCl，静置分层，取上层乙腈层 1.5 mL 加入试剂包（150 mg 无水硫酸镁和 25 mg N- 丙基乙二胺键合固相吸附剂）净化，过滤待检测。

1.3.2 液相色谱 – 质谱质谱联用法

  称 取 2.0 g 烟 末 试 样 于 50 mL 聚 乙 烯 离 心 管中，加入 10 mL 水，振荡至烟末被充分浸润。静置10 min 后 加 入 10 mL 乙 腈 和 100 µL 内 标 工 作 液（20 µg／mL Ben 的甲苯溶液），以 2 000 r／min 转速旋涡振荡 2 min，置于冰箱冷冻室中，于 –18 ℃放置10 min。再向聚乙烯管中加入试剂净化包，以 2 000r／min 转速旋涡振荡 2 min，然后以 4 000 r／min 转速离心 5 min。取上层清液 1.5 mL 于 2 mL 试剂净化管中，置于旋涡振荡仪中，以 2 000 r／min 转速旋涡 2 min，再以 4 000 r／min 转速离心 5 min，收集上清液待测。

1.4 农药残留量的计算

Ben 农药残留量 R（以干基计）按式 (1) 计算：

式中：R——以干基计的农药残留量，mg／kg ；

   c——利用标准工作曲线计算所得苯霜灵的物质的量浓度，µmol／L ；

   V——萃取液体积，mL ；

   m——样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹膜的伏安行为

  Ben 在电位 –0.2～0.6 V 范围内无电活性，可采用铁氰化钾探针作为媒介探究各修饰电极的伏安行为，印迹传感器和非印迹传感器的循环伏安图如图 1。

裸丝网印刷电极扫描后出现明显伏安响应。当用石墨烯修饰后，电极的峰电流明显升高，达 130 µ[**]，说明电极经石墨烯修饰后导电性能显著提高。当石墨烯被不导电的印迹聚合膜覆盖后，电极上的伏安峰消失，说明石墨烯表面完全被致密的不导电膜覆盖，而这层膜阻碍 K3Fe(CN)6 探针到达电极表面，导致氧化还原反应中断。当印迹膜被去除模板分子 Ben 时，伏安峰再次出现。表明印迹膜洗脱后出现印迹孔穴，使得铁氰化钾探针可到达电极表面。为了印证该印迹效果，将模板分子 Ben 再次填入印迹空穴，发现伏安峰的峰电流降低，说明膜中的传质通道被堵塞。对于非印迹传感器，由于膜洗脱前后都没有可供铁氰化钾探针传递的通道，故均无电流响应。

2.2 Ben-MIM／RGO／SPE 制备条件的优化

2.2.1 功能单体种类选择

  将 Ben 与不同的功能单体以模板∶功能单体∶交联剂为 1∶4∶60（物质的量比）的比例进行聚合，形成预聚合液，在硫酸纯化过的丝网印刷电极上进行成膜试验，成膜情况如图 2 所示。从循环伏安图的扫描峰电流可以看出，Ben 与 [**]M 形成的预聚合液所成的分子印迹膜最致密，几乎无电信号，因此选择 [**]M 为最优功能单体。

2.2.2 紫外照射条件的优化

当分子印迹膜的聚合照射时间低于 3 h 时，在SPE 上的成膜性极差，形成的分子印迹膜不致密。若时间长于 3 h，模板分子则难以从印迹膜中洗脱出来，因此将印迹膜的聚合照射时间设定为 3 h。

2.2.3 交联剂用量的优化

  利用循环伏安图考察交联剂用量对制备传感器的影响，固定模板与单体的比例为 1∶4（物质的量比），改变 EGDM[**] 的加入量，制备系列 Ben 印迹传感器，利用铁氰化钾缓冲液中的扫循环伏安图观察膜的聚合情况，如图 3 所示。结果表明，当 Ben与 EGDM[**] 的物质的量比为 1∶60 时，在丝网印刷电极上成膜性最好，且模板分子易洗脱。当二者的物质的量比小于 1∶60 时，电极上成膜不致密；而当二者的物质的量比大于 1∶60 时，则膜过于致密，从而使模板分子去除时间变长。故实验选择 Ben 与EGDM[**] 的物质的量比为 1∶60。

2.2.4 单体用量的优化

  聚合过程中模板与单体的比例对传感器的性能至关重要，在聚合体系中模板与交联剂比例固定为 1∶60 的条件下，使模板与单体的物质的量比分别为 1∶1，1∶2，1∶4，1∶5，1∶6 进行试验，结果表明，传感器对 7×10^–6 mol／L 的电流响应值先增大后减小，模板与单体的物质的量比为 1∶4 时有最大电流响应。

2.2.5 洗脱液和洗脱时间的优化

  为了获得较高的灵敏度和选择性，需要完全洗脱印迹膜中的模板分子。甲醇与乙酸的混合液是洗脱非共价型分子印迹聚合物中模板分子的常用洗脱剂，故本实验使用不同体积比的甲醇 – 乙酸混合溶液洗脱印迹膜中的模板分子 Ben。结果表明，当乙酸含量高于 50% 时，印迹膜容易被破坏，当乙酸含量低于 50% 时，模板分子的洗脱需要较长时间，因此选择甲醇与乙酸的体积比为 1∶1。当甲醇与乙酸的体积比为 1∶1 时，搅拌洗脱 15 min 后，印迹膜中的 Ben 几乎被完全去除，且膜结构不会被破坏。

2.2.6 测定过程中平衡时间的优化

  平衡步骤是提高分子印迹传感器灵敏度非常有效的方法，将洗脱好的 Ben-MIM／RGO／SPE 泡在含有 Ben 浓度为 7×10^–6 mol／L 的铁氰化钾溶液中，分别平衡 1，2，3，4，5，6 min 后进行测定，结果表明当平衡时间为 2 min 时响应值最大，且随着时间推移不再变化。

2.3 Ben-MIM／RGO／SPE 的线性范围和检出限

  为 探 讨 Ben-MIM／RGO／SPE 的 实 用 性，采用 DPV 法 绘 制 此 传 感 器 测 定 Ben 的 标 准 工 作 曲线，结 果 表 明，K3Fe(CN)6 的 峰 电 流 值 随 着 Ben 浓度 的 增 加 而 呈 线 性 降 低。 响 应 电 流 Δi（测 试 底液中不含 Ben 和含有 Ben 时的峰电流之差，μ[**]）与 Ben 的 浓 度 c 在 7.0×10^–9～2.4×10^–7 mol／L 和2.4×10^–7～6.8×10^–4 mol／L 范围内具有良好的线性关 系，线 性 回 归 方 程 分 别为 Δi=19.014 3c+0.714 6和 Δi=0.014 0c+5.579 3，相 关 系 数 分 别 为 0.997 6，0.996 8。以 3 倍 20 次空白试验结果的标准偏差除以标准工作曲线斜率计算检出限，Ben 的检出限为2.1×10^–9 mol／L。此传感器测定 Ben 的校正曲线由两部分组成，说明在传感器的印迹膜中存在两类结合位点，即对 Ben 有高亲和力和低亲和力的结合位点，这是非共价印迹聚合物／膜对模板分子产生吸附的普遍特性。

  采 用 相 同 的 聚 合 方 法 和 条 件 在 裸 SPE 表 面制 备 Ben 印 迹 膜 电 极 (Ben-MIM／SPE)，并 研 究此 电 极 测 定 Ben 的 线 性 范 围 和 检 出 限。 响 应 电流 Δi（单 位 为 µ[**]）与 Ben 的 浓 度 c 在 4.7×10^–8～6.7×10^–6 mol／L 和 6.7×10^–6～8.7×10^–5 mol／L范围内具有良好的线性关系，线性回归方程分别为 Δi=0.403 7c+4.170 6 和 Δi=0.027 2c+6.578 3，相关系数分别为 0.993 7，0.999 0。Ben 的检出限为1.4×10^–8 mol／L。 可 见 Ben-MIM／RGO／SPE 的检出限远低于 Ben-MIM／SPE，表明石墨烯的引入显著增加了传感器的灵敏度。与其它测定 Ben 的文献方法相比，Ben-MIM／RGO／SPE 传感器测定

Ben 具有相对较低的检出限、高的灵敏度和满意的线性范围（见表 1）。

2.4 电极的选择性、重现性和稳定性

试验测定了传感器在缓冲溶液中对 7.0×10–6mol／L Ben 的 DPV 响应，以及含有可能会对烟草农药残留中 Ben 测定产生影响的酰胺类杀菌剂烯酰吗啉、氟吗啉和甲霜灵时的 DPV 响应。结果表明，10 倍浓度于 Ben 的烯酰吗啉、氟吗啉和甲霜灵没有明显干扰 Ben 的测定结果，表明印迹膜的结合位点能够有效地选择 Ben，可能的干扰物并不会对 Ben的测定产生影响。 进一步试验研究了所制备电极的重现性和稳定性，用相同方法制备的 5 支传感器对相同浓度的Ben 进行测定，测定结果的相对标准偏差为 3.43% ；用同一支电极对 6.0×10^–6 mol／L 的 Ben 平行测定5 次，测定结果的相对标准偏差为 2.82%。2 周后测定 Ben 的响应值基本没有变化，使用 50 次后响应值仍能保持在初始响应的 90%，表明此电极具有较长的寿命和良好的重现性和稳定性。

2.5 实际样品分析

  将 4 个烟草样品用该实验方法进行 Ben 的检测，并进行加标回收试验，结果见表 2。由表 2 可知，电化学分析法测定结果的相对标准偏差不大于3.21%（n=5），加标回收率为 101.7%～110.4%，说明测定结果准确、可靠。

为进一步验证此传感器的测定结果，采用液相 串 联 质 谱（LC–MS–MS）法 测 定 4 个 烟 草 样 品中 的 Ben，测 定 结 果 见 表 3。 由 表 3 可 知，本 法 与

LC–MS–MS 法的检测结果基本一致。

3 结语

  以丙烯酰胺为功能单体，利用紫外引发聚合在石墨烯修饰丝网印刷电极表面制备了苯霜灵分子印迹膜，并基于系列条件优化，构建了一种操作简单、成本低廉、检测时间短的杀菌剂苯霜灵电化学检测方法，该方法对苯霜灵具有良好的线性范围和较低的检出限，并能在结构类似物的存在下选择性地识别 Ben。将所制得的印迹传感器应用于烟草样品的测定，测定结果比较理想。