纺织品的安全性与人类健康密切相关，一直是人们高度重视和极为关注的热点。在人体穿着过程中，由于汗液或湿度的作用，纺织品中部分游离重金属和金属络合染料会转移至皮肤上，危害人类健康。其中铅元素对人类健康危害巨大，铅过量会对人体神经系统、新陈代谢及遗传系统造成极大的危害并具有强致癌性。人可从消化道、呼吸道和皮肤吸收铅，然后积聚在各个脏器器官及骨骼中，所以长期接触含有铅的纺织品，会对身体健康造成严重影响。

儿童对重金属的消化吸收能力较强，而且近几年儿童铅中毒事件屡屡发生，因此纺织品中的铅含量已成为各国重视的检测项目之一。

目前，原子吸收法和等离子体发射光谱法是测定纺织品中铅离子残留量的主要方法。这两种方法虽然具备了良好的灵敏度，但对仪器要求高，且需要专业的操作人员，检测时间较长，现场检测能力不足。近年来，通过基因文库筛选，研究人员发现了大量具有金属离子结合特异性的 DN[**] 分子片段。其中，一种对铅离子具有特异性识别功能的核酸酶17E DN[**]zyme 受到研究者们的广泛关注，其作为新型的生物识别元件被广泛用于高选择性铅离子生物传感器的研发。

  笔者采用信号探针集成的 17E DN[**]zyme 作为铅离子生物识别元件和传感器的信号元件，结合高灵敏、快速、简单易操作的示差脉冲伏安法，构建了一种新型的安培型电化学生物传感器用于纺织品中铅含量的无试剂电化学检测方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  光谱仪：Cary 500UV-vis-NIR 型，美国瓦里安技术公司；

  电化学工作站：CHI660D 型，上海辰华仪器公司；

  寡聚核苷酸片段：寡聚核苷酸片段巯基功能化的 17E DN[**]zyme 核酸酶序列为 5’-HS-(CH2)6-TTT C[**]T CTC TTC TCC G[**]G CCG GTC G[**][**] [**]T[**] GTG [**]GT-3’，记作 17E，二茂铁 (Fc) 修饰的底物链序列为 5’-[**]CT C[**]C T[**]T r[**] GG[**] [**]G[**] G[**]T G-(CH2)2- Fc -3’，记作 Fc-17DS，大连 TaKaRa 生物工程有限公司；

  氯金酸：[**]u 含量不低于 47.5%，北京盈祥科技有限公司；

  柠檬酸钠：分析纯，北京盈祥科技有限公司；

  氯金酸溶液：50 mL 水和 0.167 mL10% 氯金酸的混合溶液；

  实验用水为超纯水，电阻率为 18.2 MΩ · cm。

1.2 实验方法

1.2.1 寡聚核苷酸片段浓度的标定

  采用紫外吸收法对寡聚核苷酸片段的质量浓度进行标定，即测定样品于 260 nm 处的吸收值，由相应的摩尔消光系数计算寡聚核苷酸片段的质量浓度。

  寡聚核苷酸片段所含有的各碱基摩尔消光系数之和作为其摩尔消光系数，这里 ε (d [**]) = 15 400L／(mol · cm)，ε (dG) = 11 500 L／(mol · cm)，ε ( d C ) = 7 4 0 0 L ／ ( m o l · c m ) ，ε ( d T ) = 8 7 0 0L／(mol · cm)。

1.2.2 金电极清洗和预处理

  分别采用 1.0，0.3，0.05 μm 的 α-[**]l2O3 粉抛光金电极 ([**]uE，d=3 mm) 后，再于二次水中相继超声洗涤 3 次，于 0.1 mol／L H₂SO₄ 溶液中进行电化学清洗，在 –0.2~1.6 V 电势范围内循环扫描，显现出 3个金氧化的特征峰和稳定的电流，取出电极，然后用二次水将电极表面冲洗干净，以氮气吹干。

1.2.3 金纳米粒子的制备

  于 1.94 mL 质量浓度为 0.1 mol／kg 的柠檬酸钠溶液中加入沸腾的氯金酸溶液，煮沸 10 min，得到酒红色胶体溶液，搅拌冷却至室温，即得 13 nm 的[**]uNPs 胶体溶液，于 4℃存放，备用。

1.2.4 电极传感界面的制备

将已清洁干净的金电极浸入至 1 mmol／L 的1，6- 己二硫醇的乙醇溶液中常温组装 2 h，取出后用大量乙醇清洗电极表面，以氮气吹干后浸入至[**]uNPs 胶体溶液中常温组装 1 h，然后取出用大量二次水清洗电极表面，即得 [**]uE／[**]uNPs 电极。

以 [**]uE／[**]uNPs 电极作为基底电极，首先采用50 mmol／L pH 值为 7.4 的 Tris-HCl 缓冲溶液 ( 含0.1 mol／kg NaCl ) 将巯基功能化的 17E DN[**]zyme配 制 成 为 1 μmol／L 的 组 装 溶 液，溶 液 中 包 含 6μmol／L 的三 (2- 羧乙基 ) 膦盐酸 (TCEP)，以减弱巯基功能化的 17E DN[**]zyme 发生二硫键结合作用；然后将 [**]uE／[**]uNPs 电极浸入至组装溶液中反应 12h，取出后用大量二次水清洗，再浸入至 1 mmol／L的巯基己醇溶液中 1 h，用于封闭 [**]uNPs 表面的空白位点，所制备的修饰电极记为 [**]uE／[**]uNPs／17E电极。

将电极清洗干净后于 10 mmol／L 的 Tris-HCl缓冲溶液 (pH 7.4) 中保存。将 2 μmol／L 底物链Fc-17DS 溶 液 置 于 50 mmol／L Tris-H[**]c 缓 冲 溶液 ( 含 0.1 mol／L NaCl) 中溶解，于 95℃水浴加热2 min，再于 10 min 内快速冷却至室温。将 [**]uE／[**]uNPs／17E 电极浸入至 Fc-17DS 溶液中，于 65℃水浴加热 10 min，然后逐渐冷却至室温，室温下继续反应 12 h，形成稳定的 17E／17DS 杂化结构，得到的电极即为最终的铅离子传感电极，记为 [**]uE／[**]uNPs／17E／Fc-17DS 电极。

1.2.5 试样的制备与处理

将代表性试样剪碎至 5 mm×5 mm 小片，称取0.202 3 g 试样装入消解罐中，加入 5 mL 浓硝酸，待反应完全后，将消解罐密封并放置到微波消解仪中，于 10 min 内升温至 175℃，并保持 5 min，待试样冷却 5 min 后，取出消解罐，冷却至室温，打开消解罐并将消化后的溶液转移至 50 mL 容量瓶中，用少量水淋洗消解罐 3 次，合并淋洗液于容量瓶中，用水定容至标线。

1.2.6 铅离子的电化学检测

  以 0.1 mol／kg 的 NaClO4 溶液为电解质溶液，所有电化学测定均在室温下进行。

  （1）采用传统的三电极体系。工作电极：[**]u 修饰电极 (d=3 mm) ；对电极：螺旋铂丝；参比电极：[**]g／[**]gCl( 饱和 KCl 溶液 )。

  （2）示差脉冲伏安法 (DPV) 测定条件。调整时间：50 ms ；间隔时间：0.5 s ；调制振幅：50 mV ；阶跃电势：5 mV ；扫描范围：0.15～0.55 V。

  将 [**]uE／[**]uNPs／17E／Fc-17DS 浸 入 至 一 系列含有不同浓度的铅离子 (50 mmol／mg Tris-H[**]c，0.1 mol／kg NaCl，pH 7.4) 标准溶液中，于 37℃水浴中反应 30 min 达到最大的酶切反应程度，然后将电 极 转 移 至 Tris-H[**]c 缓 冲 溶 液 中 (50 mmol／mg，0.1 mol／kg NaCl，pH 7.4) 冷却至室温，除去电极表面残留的底物链分子。将 [**]uE／[**]uNPs／17E／Fc- 17DS 电极转移至 0.1 mol／kg 的 NaClO4 电解质溶液中，进行 DPV 测定。

2 结果与讨论

2.1 传感电极检测铅离子的机理

  [**]uE／[**]uNPs／17E／Fc-17DS 传 感 电 极 对 铅 离子检测的机理示意图见图 1。由图 1 可知，传感电极 [**]uE／[**]uNPs／17E／Fc-17DS 表 面 修 饰 有 大 量电 化 学 探 针 Fc 分 子，利 用 DPV 电 化 学 技 术 可 检测到电极表面 Fc 探针产生的电流信号。当电极与待测溶液中的铅离子作用时，电极表面固定的 17E DN[**]zyme 能够识别铅离子并与其结合，产生酶效应，快速切断其底物链 Fc-17DS，破坏预杂交的双链结构，断裂的底物链 Fc-17DS 从电极表面脱落，使电极表面 Fc 分子数量减少，电化学电流信号随之减小，信号减小的程度与溶液中铅离子浓度相关。以此通过测定电极的 DPV 电流信号变化，可以实现溶液中铅离子浓度的无试剂电化学检测。

2.2 电极传感界面的 DPV 表征

  采用 DPV 技术表征了 [**]u／[**]uNPs／17E DN[**] zyme／17 DS–Fc 传感电极对 0.2 mg／g 铅离子溶液的响应情况，结果见图 2。由图 2 可知，对于所构筑的 [**]u／[**]uNPs／17E DN[**]zyme／17 DS–Fc 传 感 电极，其 DPV 响应曲线上显示出一个明显的 DPV 氧化峰电流 (a 曲线 )，此峰电流对应着电极界面上 Fc的电化学氧化反应。当传感电极 [**]u／[**]uNPs／17E DN[**]zyme／17 DS–Fc 与 0.2 mg／g 的铅离子溶液发生作用后，传感电极表面修饰的 17E DN[**]zyme 能够识别铅离子并与其结合，从而产生酶效应，快速切断其底物链 Fc-17DS，破坏预杂交的双链结构，底物链 Fc-17DS 断裂并从电极表面脱落，电极表面的 Fc探针分子减少，导致传感电极的 DPV 峰电流信号降低 (b 曲线 )。

2.3 传感电极对铅离子的检测

  在考察传感电极对溶液中铅离子浓度的检测性能前，考察了传感电极与铅离子溶液的孵育时间对电极电化学信号的影响，结果发现，传感电极与铅离子溶液作用 25 min 后，电极的 DPV 电流信号基本达到稳定，为了使其作用更完全，同时节约检测时间，采用的孵育时间为 30 min。

  在孵育时间优化的条件下，考察了质量浓度分别为 0，0.002，0.02，0.20，2.0，20.0 mg／kg 的铅离子标准溶液（分别编号为 a，b，c，d，e，f）对传感界面的影响，结果见图 3。由图 3 中可知，随着铅离子浓度的升高，传感电极的 DPV 峰电流信号逐渐降低，证明了传感界面对铅离子产生了识别以及发生了酶切反应。

2.4 线性方程与检出限

以电极 DPV 峰电流信号的变化率 ( I₀–I )／I₀ 为纵坐标 ( y )，铅离子质量浓度 c 对数 lgc 为横坐标( x ) 进行线性拟合，线性回归方程为 y=0.11x+0.02，相关系数 (r²) 为 0.992 4。方法检出限 (S／N=3) 为 1.3μg／kg。铅离子的质量浓度在 2.0～0.020 μg／kg范围内，其对数 lgc 与电极 DPV 峰电流信号的变化率 ( I₀–I )／I0 呈良好的线性关系。

2.5 传感电极对铅离子检测的选择性

  采用其它 8 种可能对铅离子检测造成干扰的二价金属离子 (Zn²⁺，Co²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺) 进行对比试验，考察了 [**]u／[**]uNPs／17E DN[**] zyme／17 DS–Fc 传感电极对铅离子检测的选择性。传感电极对质量浓度为 2.0 mg／g 不同金属离子检测的结果见图 4。由图 4 可知，其它 8 种金属离子不会引起明显的 DPV 信号变化，说明了所研制 的 [**]u／[**]uNPs／17E DN[**] zyme／17 DS–Fc 传 感器对铅离子检测具有较好的选择性。

2.6 精密度试验

  分别选取棉、麻、毛、涤纶 4 种纺织纤维为代表性样品，参照标准 GB／T 30157–2013《纺织品 总铅和总镉含量的测定》中实际样品前处理方法进行制备。采用 1.2 实验方法对样品中的铅含量进行 6次平行测定，试验结果见表 1。

 由表 1 可知，4 种样品中铅含量测定结果的相对标准偏差为 2.5%~4.0%，表明该方法具有较好的精密度。

2.7 加标回收试验

  对上述棉、麻、毛、涤纶 4 种实际样品进行加标回收试验，考察该传感电极对实际纺织样品中铅含量检测的准确度。按 1.2 方法对每种样品进行 3 次平行测定，加标回收试验结果见表 2。由表 2 可知，4 种样品的回收率为 91.4%～105.3%，说明该方法具有较高的准确度。

2.8 比对试验

  分别采用本法与国家标准方法 (GB／T 30157–2013) 对 4 个不同铅离子含量的纺织品样品进行测定，比对试验结果见表 3。由表 3 可知，本方法测定结果与国家标准方法的测定结果基本一致，具有良好的相关性，表明该方法对铅离子的测定结果准确、可靠。

3 结语

基 于 探 针 集 成 的 17E DN[**]zyme 识 别 分 子 与DPV 电化学技术的结合，构建了一种安培型铅离子电化学生物传感器。通过化学修饰的手段在生物识别元件 17E DN[**]zyme 分子体系上集成了电化学信号探针分子 Fc，并成功将其修饰于电化学电极表面。采用示差脉冲伏安法对铅离子进行检测时，传感电极本身产生电化学信号，实现了对溶液中铅离子的无试剂电化学检测。通过对不同浓度的铅离子加标溶液的检测，随着铅离子浓度升高，传感电极的DPV 峰电流信号逐渐降低，该传感器具有良好的选择性和较宽的线性范围以及较低的检测限。采用该生物传感器对实际纺织品样品中的铅含量检测，测定结果具有良好的精密度和准确度。