香菇中因含有大量多糖、嘌呤、核酸及硫香味等成分，食用价值和营养价值均较高，并且有抗癌、降压等药用价值。由于菌类生长繁殖的特殊性，若基质载体被污染或引入农药抗病虫害，易导致香菇中农药残留量超标，既影响人们的饮食健康又不利于产品出口。为保障食用菌安全，各国都加强了农药残留的监控，相继出台了一系列食用菌中农药限量标准，我国也制定了相关标准限制和规范食品中农药的使用。因此快速准确地检测香菇中的农药残留在食品检测领域备受关注。

   香菇是一种复杂的基质，而农药种类多，性质差别大，建立多残留分析方法对于香菇中多类别农药同时筛查具有重要意义，既节省了时间和试剂，又能及时准确地提供检测数据。目前已有一些比较成熟的检测方法，王会锋等利用电子捕获检测器(ECD)、火焰光度检测器(FPD)等对香菇中的农药残留检测进行了研究；骆冲等用紫外–液相检测器检测香菇等食用菌中农药残留；伊雄海等采用飞行时间质谱等手段实现香菇中农残的快速检测；梁达清等用液质串联法检测香菇中的有机磷残留。此外还有流动注射法、传感技术等应用于香菇中农残的检测。由于质谱特有的高选择性，对于多组分农药残留，气相色谱–质谱联用和液相色谱–质谱联用已成为主流检测方式。对于多菌灵等农药，液相色谱–质谱联用不需要气化，其优势更明显。超高效液相色谱–串联质谱法分离时间短，采用多反应离子监测，灵敏度高，可以同时定性定量分析多种化合物，适用于热稳定差和极性较强的农药检测。上述研究前处理方法比较繁琐，多农药检测时不够便捷，和液相色谱–质谱检测方法相比，气相色谱–质谱法检测稳定性差，多农药检测时选择性不佳。因此，如何同时快速有效地检测多种农药成为当前的研究热点。笔者针对香菇基质中常见的29种农药残留，用简便的方法进行前处理，采用超高效液相色谱–串联质谱仪同时检测。该方法操作简单，重复性好，能准确快速检测大批量样品中的多农药残留，适用于香菇市场准入和监测。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

   液相色谱–串联质谱仪：Xevo-TQ–S型，美国waters公司；

   匀浆机：SilentCrusherM型，德国Heidolph公司；超纯水机：Milli-Q[**]dvantage[**]10型，美国Millipore公司；

   离心机：UNIVERS[**]L320R型，德国Hettich公司；

   29种农药标准品：纯度不低于95%，编号及农药名称见表1，农业部天津环境保护科研监测所；

   乙腈、甲醇、甲酸：色谱纯，德国默克公司；

   C18粉、N–丙基乙二胺吸附剂(PS[**])：色谱纯，美国安捷伦科技有限公司；

   氯化钠、无水硫酸镁：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

   实验用水为超纯水。

1.2溶液的配制

   29种单一农药标准储备液：80μg／mL，准确吸取29种农药标准品各800μL于10mL容量瓶中，根据各农药的性质用甲醇、丙酮等溶剂溶解并定容至标线，制得29种单一农药标准储备液，置于–18℃冰箱中密封储存备用。

   混合标准储备液：4μg／mL，分别移取一定量的上述单一农药标准储备液于10mL容量瓶中，用甲醇、丙酮定容至标线，配制成3类混合标准储备液，分别为甲醇稀释的多菌灵等11种(表1中序号9～19)农药混合标准储备液，甲醇稀释的涕灭威等8种(表1中序号1～8)农药混合标准储备液，丙酮稀释的氟虫腈等10种(表1中序号20～29)农药混合标准储备液，置于–18℃冰箱中密封储存备用。

1.3仪器工作条件

1.3.1色谱仪

   色谱柱：[**]cquityUPLCBEHRPC18柱(50mm×2.1mm，1.7μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温40℃；流动相：[**]相为乙腈，B相为0.1%甲酸溶液；流量：0.3mL／min；梯度洗脱程序：0～2min为10%～30%[**]，2～8min为30%～90%[**]，8～9min为90%～10%[**]，保持1min；进样体积：1μL。

1.3.2质谱仪

   电离方式：电喷雾离子源(ESI)；离子源温度：150℃；脱溶剂气：高纯氮气，温度为500℃，流量为1000L／h；锥孔气：高纯氮气，流量为40L／h；扫描方式：序号1～25农药采用正离子扫描，序号26～29农药采用负离子扫描；监测方式：多反应监测模式(MRM)；保留时间、母离子、子离子、锥孔电压及碰撞能量参数见表1。

1.4样品处理

   准确称取(10.00±0.05)g新鲜样品，置于50mL塑料离心管中，加入20mL0.1%甲酸–乙腈溶液，匀浆提取1min，再加入5gNaCl振荡3min，以5000r／min离心5min。取10mL上清液至10mL玻璃离心管中，用50℃氮气吹至近干。然后用2mL洗脱液甲醇–二氯甲烷(体积比为5∶95)溶解残渣，以4mL洗脱液活化NH4固相萃取柱，15mL洗脱液洗脱，收集滤液，于40℃下氮吹至近干，用5mL乙腈–水溶液(体积比为1∶1)定容至标线，混匀，过0.22μm滤膜，待测。

2结果与讨论

2.1提取溶剂的选择

   由于待测农药种类多，化学性质差别大，如异丙威、甲萘威、克百威等在碱性介质中不稳定，易分解，因此选用溶解能力强、性质稳定的乙腈作为提取剂。分别考察乙腈、0.1%甲酸–乙腈溶液和1%甲酸–乙腈溶液为提取剂，添加浓度为0.05mg／kg时香菇中29种农药的回收率。结果表明，纯乙腈为提取剂时，回收率为71.0%～102.7%；0.1%甲酸–乙腈溶液为提取剂时，回收率为82.1%～100.2%；1%甲酸–乙腈溶液为提取剂时，回收率为75.2%～105.8%。0.1%甲酸–乙腈溶液为提取剂时，回收率普遍较高且稳定；并且其酸性较弱，对色谱柱等损害小，因此选择0.1%甲酸–乙腈溶液为提取剂。

2.2净化方法优化

   根据农药性质不同，选用氨基固相萃取柱净化，分别用甲醇–二氯甲烷溶液(体积比为5∶95)和乙腈洗脱；石墨碳黑氨基柱净化，甲苯–乙腈溶液(体积比为3∶8)洗脱。分别考察两种净化柱、3种洗脱溶剂和QuEChERS净化包(PS[**]400mg，C18400mg，无水硫酸镁1200mg)在添加浓度为0.05mg／kg时对29种农药回收率的影响，试验结果见表2。由表2可知，用氨基柱净化，甲醇–二氯甲烷溶液洗脱时，大多数农药回收率在81.2%～101.7%之间，符合农业部农残检测标准；用乙腈洗脱时，苯醚甲环唑、哒螨灵、二甲戊灵等由于极性较弱洗脱效果不佳，回收率均低于70%。用石墨碳黑氨基柱净化，甲苯–乙腈溶液洗脱时，29种农药的回收率均较高，但洗脱剂用量较大，增加下一步氮吹时间，不利于大批量样品的检测。QuEChERS净化包净化时，由于C₁₈粉吸附了非极性的苯醚甲环唑、哒螨灵、二甲戊灵，致使其回收率较低；而氟啶脲由于极性较强吸附在PS[**]上，回收率也较低。此外，不同净化方法对空白香菇基质的影响也不相同，氨基柱净化，不同洗脱剂洗脱对基质影响不大；石墨碳黑氨基柱净化，基质较干净，进样后基线噪音明显降低；QuChERS净化包净化，在液相色谱–质谱法测定时，基线噪音高，基质干扰较大。综合考虑，选择氨基柱净化，甲醇–二氯甲烷溶液洗脱。

2.3洗脱剂用量的选择

   固相萃取小柱对药物的吸附能力不同，洗脱溶剂用量对回收率也有一定影响。分别考察10，15，20mL洗脱溶剂对回收率的影响。结果表明当洗脱剂体积为15mL时，29种农药的回收率均在80%以上，因此选择15mL作为洗脱剂用量。

2.4基质效应

   比较空白样品提取后添加回收与纯溶剂中加相同浓度标样的离子响应强度，通过二者比值来评价基质效应(ME)。根据刘进玺等对基质效应的描述，若ME＜100%，说明基质对分析物的响应产生抑制作用；ME＞100%，说明基质会增强分析物的响应；ME＝100%，表示不存在基质效应。以体积比为1∶1的乙腈–水溶液配制成浓度分别为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2μg／mL的溶剂标准溶液，同时称取空白香菇样品，按照1.4样品处理方法，将进样液稀释成与溶剂标准溶液浓度相同的基质匹配标准样品，在1.3仪器工作条件下进行测定，比较目标化合物在基质和溶剂中的峰面积，得到基质效应。结果表明，大部分化合物基质响应相对强度在80%～120%之间，基质效应不明显。涕灭威亚砜等极性较强的氨基甲酸酯类化合物有较明显的基质抑制作用，阿维菌素、苯醚甲环唑有基质增强作用，并且浓度越低基质效应越明显。

2.5线性方程与检出限

   将空白样品按1.4方法处理后配制成质量浓度分别为0.0001～0.01，0.01～0.1，0.1～1μg／mL的系列标准工作溶液，在1.3仪器工作条件下分别进样测定，以各农药的质量浓度(x)为横坐标，以色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。以3倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限。29种农药的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表3。由表3可知，29种农药在各自的质量浓度范围内与其色谱峰面积呈良好的线性相关性，相关系数大于0.995，检出限为0.0001～0.002mg／kg。该方法能够满足测定要求。

2.6加标回收与精密度试验

   在空白香菇样品中分别添加4μg／mL的3种混合标准储备液50，125，250μL，理论添加浓度分别为0.02，0.05，0.1μg／mL，每一组分设6个平行样，按1.4方法处理样品，在1.3仪器工作条件下分别进样测定，结果见表4。由表4可知，29种农药的平均回收率为81.3%～97.9%，测定结果的相对标准偏差为2.0%～8.4%。表明该方法有较高的精密度和准确度，满足检测要求。

2.7实际样品测定

   采用所建立的方法对3个蔬菜基地抽取的香菇样品中29种农药残留进行检测。结果发现3种样品中多菌灵都有检出，其含量测定值为0.004～0.008mg／kg，一种样品检出0.005mg／kg咪酰胺，其它农药均未检出。

3结语

   建立了同时测定香菇中29种农药残留的超高效液相色谱–串联质谱法。该方法在国标GB23200.12–2016前处理方法基础上加入0.1%甲酸溶液，提取率可以达到国标要求的回收率范围，29种农药回收率普遍较高且稳定，其中异丙威、甲萘威、阿维菌素等的回收率有显著提高。样品用氨基固相萃取小柱净化，在保证回收率的前提下，基质干扰最小，操作简单快速。评价基质效应的方式与刘进玺等人类似，确定了29种农药在香菇中的基质效应，即涕灭威砜等氨基甲酸酯类农药有明显的基质抑制效应，阿维菌素、苯醚甲环唑有基质增强作用，并且浓度越低基质效应越强，其它大部分农药基质效应不明显。该方法确立的实验条件为0.1%甲酸–乙腈溶液为提取剂，氨基固相萃取柱净化，甲醇–二氯甲烷(体积比为5∶95)洗脱，洗脱剂用量为15mL。该方法前处理过程简单，检测时间短，准确度高，在农产品市场准入和市场监督中，可用于大批量样品检测，为香菇中多农药残留的检测提供一条便捷途径，也为香菇的食用安全提供技术支撑。