4标准物质中有机溶剂及有机杂质的定值

4.1定值方法

   辛基二茂铁是一种极性很小的金属有机化合物，依据其合成、分离提纯工艺，可以判断这类候选物中的水分及无机杂质含量很低，其主要杂质应为残留的有机溶剂和有机杂质，因此需要对残留的有机溶剂及有机杂质进行准确定值。

   为了对其进行准确定值，首先要分析各有机溶剂、有机杂质结构，确定杂质组成。依据不同类型的杂质选用相应的定值方法。采用气相色谱–质谱联用技术、核磁共振技术确定候选物中各杂质的结构，用气相色谱面积归一化法对主成分相对纯度进行估测，杂质种类及定值方法等见表4。

   由表4可以看出，候选物中除了残留的有机溶剂外，还含有多种二茂铁的同系物杂质，对这些杂质进行高精度定值是定值工作的重点和难点。与高效液相色谱法相比，气相色谱法对微量有机溶剂及有机杂质的定值具有分离效率高，可高精确定量测定的特点，因此采用气相色谱法对各杂质进行定值。选用气相色谱法对上述残留有机溶剂、有机杂质进行定值时首先要选择上述各杂质的标准物质或工作标准。

   对残留溶剂正己烷定值时选用色谱纯的正己烷为工作标准，纯度以100%计，萘为内标。

   对残留在(3-辛基)二茂铁中的同分异构体杂质，如(2-辛基)二茂铁和(4-辛基)二茂铁定值时，选用本方法制备的(2-辛基)二茂铁和(4-辛基)二茂铁候选物为工作标准，纯度以100%计，内标法定值，以纯度大于99.5%的正辛基二茂铁为内标。

   对于二茂铁同系物杂质1-丙基-3-戊基二茂铁和1，1-二丁基二茂铁，由于目前国内外没有相应的标准物质，也没有相关的试剂或工业品。按照《中华人民共和国药典(2015年版)》第四部(以下简称《药典》)，拟采用不加校正因子的主成分自身对照法进行定值。

4.2定值结果

4.2.1残余溶剂

   按照4.1方法对残余溶剂正己烷进行定值，定值结果见表5。

4.2.2有机杂质

   按照表6精密配制各溶液。选择色谱纯的正己烷为工作标准，纯度以100%计，萘为内标，对其进行精确定值。

   取不同体积含内标的候选物样品溶液，梯度进样(2.4，3.2，4.0，4.8，5.6，6.4μL)，记录内标物与候选物主成分的色谱峰面积[**]_n，[**]_d，分别绘制主成分浓度和内标浓度对其色谱峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与内标回归直线斜率之比计算校正因子ƒi，结果见表7。

   对3种辛基二茂铁同分异构体标准物质候选物的有机杂质进行定值，对样品共测试12组数据，采用格拉布斯(Grubs)法或狄克逊(Dixon)法进行统计，剔除可疑值，求得平均值及标准偏差。

   依据保留时间确定同分异构体杂质种类i并记录其色谱峰面积，按式(1)计算相应杂质浓度，进而得到其在候选物中的相对含量。

式中：c_x——候选物的质量浓度，mg／mL；

   ƒ_i——候选物i相对于内标的校正因子；

   [**]_x ——候选物的色谱峰面积；

   c_s——内标物的质量浓度，mg／mL；

   [**]_s——内标物的色谱峰面积。

   表8为候选物Ⅱ中的杂质(3-辛基)-二茂铁和候选物Ⅲ中杂质(2-辛基)-二茂铁与(4-辛基)-二茂铁的定值结果。

   采用药典2015第四部所述的不加校正因子主成分自身对照法对候选物中的杂质1-丙基-3-戊基二茂铁、1，1-二丁基二茂铁进行定值，按式(2)计算。

   ω_i=[**]_i／[**]₁       (2)

式中：ωi——样品中有机杂质的含量，g／g；

    [**]i——有机杂质的色谱峰面积；

    [**]1——内标物的色谱峰面积。

   表9为候选物Ⅱ中1,1-二丁基二茂铁和1-丙基-3-戊基二茂铁杂质的定值结果。

5标准物质定值结果

5.1定值结果及验证

   根据机杂质定值分析结果，得到3种辛基二茂铁同分异构体标准物质的定值结果，见表10。

   利用气相色谱(面积归一化法)对定值结果进行验证。假设两种方法的定值结果均服从正态分布，采用t检验法，构造统计量t：

式中：X——样品中杂质i的平均值；

   u₀——样品中杂质i的总体均值；

   s_n——样品中杂质i的标准差；

    n——样品容量。

   给定显著性水平α=0.01，查表可得临界值t_0.005(11)=3.1058，两种方法检测结果无显著差异的拒绝域：

对候选物Ⅱ进行检验，自身对照法给定样本值为99.47%，气相色谱面积归一化法给定样本值为99.40%，99.45%，99.52%，99.30%，99.36%，99.49%，99.36%，99.49%，99.36%，99.60%，99.54%，99.50%，99.49%，99.48%。根据式(3)计算得t的观察值;t;=1.713.1058，故接受假设，两种方法在统计学上无显著性差异。

   同样：候选物Ⅲ的t观察值;t;=1.313.1058，候选物Ⅳ的t观察值;t;=2.413.1058。证明两种方法定值结果在统计学上无显著性差异。

5.2定值不确定度分析

   制备的辛基二茂铁同分异构体标准物质是一种极性较小的金属有机化合物，3种标准物质均为均匀的液体，加之二茂铁芳香结构稳定性好，故均匀性和储存稳定性引起的不确定度均不考虑。重点考察杂质中溶剂、辛基二茂铁同分异构体等有机杂质定值的不确定度。

   根据JJF1059.1–2012《测量不确定度的评定和表示》计算其标准不确定度，计算时需分别估算[**]类不确定度和B类不确定度，[**]类不确定度评定结果由贝塞尔公式法计算得出，按文献[16]合理估计B类不确定度，有机溶剂及有机杂质的定值不确定度见表11。

   对表11中各不确定度分量进行合成，得3种辛基二茂铁同分异构体标准物质定值结果不确定度和扩展不确定度，定值结果及不确定度见表12。由表12可知，研制的辛基二茂铁同分异构体标准物质的纯度分别为99.5%，99.5%，99.9%，扩展不确定度均为0.2%(k=2)。

6结语

   利用环糊精包结分离制备得到3种高纯度辛基二茂铁同分异构体，用气相色谱法考察了3种高纯辛基二茂铁同分异构体标准物质候选物的均匀性和稳定性，采用气相色谱–质谱联用技术、核磁共振技术确定候选物中各杂质的结构从而确定杂质的种类。依据有机杂质有无标准物质，分别采取内标法以及不加校正因子的主成分自身对照法对其中辛基二茂铁同分异构体杂质进行定值，并对定值结果的不确定度进行了评定。3种辛基二茂铁标准物质的纯度均大于99.5%。该标准物质定值结果准确，为相关物质的分析检测提供了量值溯源标准。