干眼症是较为常见的眼科疾病，主要以泪膜稳态失衡为主要特征，并伴有眼部不适症状，是一种多因素眼表疾病。随着环境恶化，电子产品的普及及不良的用眼习惯，干眼症临床患病率不断攀升，给患者视力及生活造成极大干扰。干眼症的临床治疗常以人工泪液提升眼球表面湿度，增加润滑度，从而改善眼球环境，然而人工泪液单从改善眼球环境入手，并未对疾病进行治疗，临床作用时间短，效果不佳。

  人溶菌酶是一种人体内天然存在的蛋白质，它借助几种酶或非酶物质共同作用溶解细菌细胞壁，从而达到杀菌效果。哺乳动物体内的细胞无细胞壁，故溶菌酶无靶向位点，对人体细胞不会产生破坏作用。重组人溶菌酶不仅具有人溶菌酶抗菌、抗病毒、抗炎等优点，同时也克服了人溶菌酶活性低、产量低、不便于制备、无法稳定保存等缺点。人的泪液中含有溶菌酶，模仿人体内泪液主要成分，以重组人菌酶、透明质酸钠等为主要原料制成滴眼液，增加眼表湿度、润滑度，用于改善干眼症症状的同时，还可有效抑制相关炎症因子的释放，从而减轻患者的炎症反应，改善其临床症状，具有广阔的临床应用前景。

  改良咔唑法是目前透明质酸钠含量测定应用最广的方法之一，其原理：以硼砂作催化剂，用硫酸将透明质酸钠进行酸解，分离出葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸与咔唑反应形成有机络合物，该络合物显示特有的紫色，其吸光度与葡萄糖醛酸的浓度成正比。通过测定葡萄糖醛酸的含量间接确定透明质酸钠的含量。与对温度要求较高的阿利新蓝染料法、成本高昂且耗时较长的定量试剂盒法、测定条件苛刻的高效液相色谱法相比，改良咔唑法具有显色迅速稳定，重复性好等优点。目前国内外文献中并无改良咔唑法应用于重组人溶菌酶滴眼液中透明质酸钠含量测定的报道，笔者将改良咔唑法应用于重组人菌酶滴眼液中的透明质酸钠含量测定，并对测定条件进行了优化，传统的咔唑法显色后冷却方式为自然放冷，笔者试验过程中发现在自然放冷的过程中体系的吸光度下降明显，因此将自然放冷方式改为冰水浴迅速冷却，延长了显色体系的稳定时间，更有利于样品的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

 紫外可见分光光度计：1800 型，日本岛津公司；

 浓硫酸、咔唑、十水合四硼酸钠、无水乙醇：分析纯；

  D- 葡萄糖醛酸对照品：纯度为 99.1%，中国药品生物制品检定所；

  D- 葡萄糖醛酸对照品溶液：0.06 mg／mL，精密称取 D- 葡萄糖醛酸对照品 0.100 0 g，置于 100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至标线，制成 1 mg／mL的溶液，摇匀，作为 D- 葡萄糖醛酸标准贮备液，精密量取 6 mL D- 葡萄糖醛酸标准贮备液于 100 mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀，于 4℃下贮存；

  硼砂 – 硫酸溶液：0.025 mol／L，称取十水合四硼酸钠（Na2B4O7 · 10H2O）4.767 3 g，加入到 1 L 浓硫酸中，加盖，不定时振摇，直至十水合四硼酸钠完全溶解，于室温下贮存；

  咔唑 – 乙醇溶液：0.125%，精密称取咔唑 0.125 4g，用 100 g 无水乙醇溶解，于 4℃冰箱避光保存，有效期为 15 天；

  重组人溶菌酶滴眼液样品：以重组人溶菌酶、透明质酸钠为主要原料按一定的料液比自制，批号分别为 201710008，201710009，201710010 ；

  重组人溶菌酶滴眼液样品溶液：取重组人溶菌酶滴眼液 0.7 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用纯水定容至标线，摇匀；

 实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

  精密量取重组人溶菌酶滴眼液样品溶液  1 mL，于冰浴中冷却，在不断振摇下缓缓滴加硼砂 – 硫酸溶液 5.0 mL，密塞，于沸水浴中加热 15 min（中间振摇一次），于冰水浴中迅速冷却，加入咔唑 – 乙醇溶液 0.2 mL，摇匀，于沸水浴中加热 20 min（中间振摇一次），于冰水浴中迅速冷却。以空白溶液为参比，于 530 nm 波长处测定吸光度。由线性方程计算葡萄糖醛酸的含量，透明质酸钠含量按式 (1) 计算：

                     X=c_x×2.067 5D                         (1)

   式中：X——重组人溶菌酶滴眼液样品中透明质酸钠的含量，mg／mL ；

   cx——根据重组人溶菌酶滴眼液样品的吸光度，从标准工作曲线上查得的对应葡萄糖醛酸的质量浓度，mg／mL ；

   2.067 5——透明质酸钠重复双糖单元与葡萄糖醛酸相对分子质量的比值；

   D——重组人溶菌酶滴眼液样品的稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 显色条件

2.1.1 分析波长

  取 D- 葡萄糖醛酸对照品溶液，按 1.2 实验方法操作，经显色后，在 500～600 nm 波长区间进行扫描，吸收光谱图如图 1 所示。由图 1 可知，溶液在 530 nm 处有最大吸收，故选择 530 nm 作为分析波长。

2.1.2 硼砂 – 硫酸溶液的用量

浓硫酸可将透明质酸钠分解为 D- 葡萄糖醛酸，D- 葡萄糖醛酸与咔唑反应形成有机络合物，该络合物显示特有的紫色，其吸光度与 D- 葡萄糖醛酸的浓度成正比。硼砂 – 硫酸溶液的加入量直接影响反应的速度。在水解温度 100℃、咔唑 – 乙醇溶液用量 0.2 mL、显色加热时间 20 min 的条件下，分别加入 1～10 mL（间隔 1 mL）硼砂 – 硫酸溶液，对重组人溶菌酶滴眼液样品溶液进行水解并显色，然后测定溶液的吸光度，结果表明硼砂 – 硫酸溶液的加入量为 5 mL时吸光度最大，因此选择加入 5 mL 硼砂 – 硫酸溶液。

2.1.3 水解温度

  在 硼 砂 – 硫 酸 溶 液 的 加 入 体 积 为 5 mL、咔唑 – 乙醇溶液的用量为 0.2 mL、显色加热时间 20 min 条件下，分别设置水解温度为 30～100℃ ( 间隔10℃ ) 对重组人溶菌酶滴眼液样品溶液进行水解并显色，然后测定溶液的吸光度，结果表明水解温度为 100℃时溶液的吸光度最大，故选择水解温度为100℃。

2.1.4 显色加热时间

在硼砂 – 硫酸溶液的加入体积为 5 mL、咔唑 –乙醇溶液的用量 0.2 mL、水解温度为 100℃的条件下，分 别 选 择 显 色 加 热 时 间 为 0～40 min（间 隔 5 min），对重组人溶菌酶滴眼液样品溶液进行水解并显色，然后测定溶液的吸光度，结果表明随着加热时间的延长，溶液的吸光度逐渐增大，加热 20 min 后吸光度趋于稳定，因此选择显色加热时间为 20 min。

2.1.5 咔唑 – 乙醇溶液的用量

  在硼砂 – 硫酸溶液的加入体积为 5 mL、水解温度为 100℃、显色加热时间为 20 min 的条件下，分别选择咔唑 – 乙醇溶液的加入体积为 0.0～1.0 mL( 间隔 0.1 mL)，对重组人溶菌酶滴眼液样品溶液进行水解并显色，然后测定溶液的吸光度，结果表明咔唑 –乙醇溶液的用量为 0.2 mL 时溶液的吸光度最大，故选择咔唑 – 乙醇溶液的用量为 0.2 mL。

2.1.6 显色后冷却方式

  在硼砂 – 硫酸溶液的加入体积为 5 mL、水解温度为 100℃、显色加热时间为 20 min，咔唑 – 乙醇溶液的加入量为 0.2 mL 的条件下，对重组人溶菌酶滴眼液样品溶液进行水解并显色，显色后分别采取室温下自然冷却、冰水浴迅速冷却两种方式进行冷却。由于显色温度为 100℃，在室温下自然冷却，冷却时间较长，在自然冷却的过程中吸光度逐渐下降，在冷却 30 min 后吸光度下降了 3.2% ；在冰水浴中迅速冷却条件下，分别放置 0～90 min，每间隔 10 min 测量溶液的吸光度，结果表明放置 90 min 后溶液的吸光度仅下降了 0.7%。相比文献中的室温自然冷却，冰水浴迅速冷却延长了体系的稳定时间，更有利于样品的测定，故显色后选择冰水浴冷却。

2.2 线性方程与检出限

精密量取 D- 葡萄糖醛酸对照品标准溶液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL，分别置于 25 ml 具塞试管中，依次分别加入水至 1.0 mL，混匀，于冰浴中冷却，在不断振摇下缓缓滴加硼砂 – 硫酸溶液 5.0 mL，密塞，于沸水浴中加热 15 min（中间振摇一次），用冰水浴迅速冷却，加入咔唑无水乙醇溶液 0.2 mL，摇匀，于沸水浴中加热 20 min（中间振摇一次），再用冰水浴迅速冷却。以空白溶液为参比，于 530 nm 波长处测定吸光度，以溶液的浓度（x，mg／mL）为自变量、吸光度（y）为因变量进行线性回归，得线性方程为 y=11.183x–0.021 2，线性相关系数（r2）为 0.999 1，线性范围为 0.012～0.060 mg／mL。以《中华人民共和国药典》2015 年版第三部［16］推荐的检测限测定方法，对空白溶液平行测定 6 次，按照 LOD=3.3s／k( 标准偏差 s 为 2.63×10–3，k 为线性方程斜率 ) 进行计算，得方法检出限为 0.8 µg／mL。

2.3 重复性试验

  取重组人溶菌酶滴眼液样品溶液，按照 1.2 实验方法重复测定 6 次，吸光度测定结果见表 1。由表 1 可 知，吸 光 度 测 定 结 果 的 相 对 标 准 偏 差 为2.15%，表明本方法重复性良好。

2.4 加标回收试验

  按照处方配比不加透明质酸钠制备重组人溶菌 酶 滴 眼 液 样 品 1 mL，分 别 精 密 加 入 D- 葡 萄 糖醛酸标准储备液 0.8，1.0，1.2 mL，用纯水定容至 25 mL，各制备 3 份，共 9 份样品，按照 1.2 实验方法进行测定并计算加标回收率，结果见表 2。由表 2 可知，D- 葡萄糖醛酸的平均加标回收率为 99.9%，表明本法测量准确度较高。

2.5 样品测定

  取 3 批重组人溶菌酶滴眼液样品，按照 1.2 实验方法进行测定，测定结果见表 3。重组人溶菌酶滴眼液中透明质酸钠的标示含量为 1 mg／mL，由表3 可知，本法测得值与标示值基本一致，测量误差在药品质量标准规定的（1.0±0.1）mg 范围之内，说明本方法测定不同批次的产品重复性较好。

3 结语

  将改良咔唑法应用于重组人溶菌酶滴眼液中透明质酸钠含量的测定，对显色条件进行了优化，将冷却方式改为冰水浴迅速冷却，延长了样品的稳定时间，更有利于样品的测定。该方法准确度高，重复性好，符合《中华人民共和国药典》2015 年版第三部中关于回收率和重复性可接受范围的要求［16］。三批次产品测定结果在质量标准规定的范围内，方法稳定可靠，含量测定结果准确，为重组人溶菌酶滴眼液质量控制体系的完善提供可靠依据。