食品安全问题关系国计民生，其中食品添加剂科学合理使用是公众热门话题。油脂中的抗氧化剂尤其是合成类抗氧化剂的使用是目前消费者广泛关注的食品安全问题。油脂及油炸食品中常需要添加抗氧化剂延长油品氧化反应的诱导期，减缓油品氧化速度，延长油品的使用寿命。合成酚类抗氧化剂是一类高效、通用的油脂抗氧化剂，应用前景广阔。目前最常用的抗氧化剂有没食子酸丙酯 (PG)、叔丁基对苯二酚 (TBHQ)、叔丁基对羟基茴香醚 (BH[**])、二丁基羟基甲苯 (BHT) 等，这些抗氧化剂可单独使用，也可混合使用。长期过量食用含抗氧化剂的食品，会对人体健康造成不利影响。因此很多国家对食用抗氧化剂的使用均有严格的限量，甚至部分抗氧化剂被某些国家禁止使用。GB 2760–2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定了食用植物油中 6 种合成类抗氧化剂的使用限量：TBHQ 为 0.2 g／kg，BH[**] 为 0.2 g／kg，BHT 为 0.2 g／kg，PG 为 0.1 g／kg，山梨酸为 1.0 g／kg，没食子酸为 0 g／kg，可见快速且准确测定植物油脂中 6 种合成抗氧化剂的含量具有重要意义。

目前食品中抗氧化剂的检测方法已成熟，TBHQ，BH[**]，BHT，PG 等抗氧化剂的检测方法多不胜举，食品中山梨酸的检测方法也很多，但TBHQ，BH[**]，BHT，PG，没食子酸，山梨酸同时检测的方法尚未见报道，主要是因为 TBHQ，BH[**]，BHT和 PG 偏脂溶性，而没食子酸和山梨酸偏水溶性。为了能高通量检测食用植物油中的 6 种抗氧化剂，笔者建立了一种快速的高效液相色谱法，该方法操作步骤简单，适用于多种食用植物油中合成抗氧化剂的测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

  液相色谱仪：[**]gilent1260 series 型，配 有 FLD和 D[**]D 检测器，美国安捷伦科技公司；

  分析天平：X205BDU 型，感量为 0.1 mg，瑞士梅特勒 – 托利多公司；

  纯水器：Milli-Q [**]cademic 型，美国密理博公司；振荡器：IK[**]–KS130 型，德国艾卡公司；

  乙腈：色谱纯，北京盈有限公司；冰乙酸：分析纯，北京盈有限公司；

  PG 对照品：纯度为 99%，C[**]S 号 121–79–9，北京盈有限公司；

  TBHQ 标准品：纯度为 99.6%，C[**]S 号为 1948–33–0，德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；

  BH[**] 标准品：纯度为 99.0%，C[**]S 号为 25013–16–5，德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；

  BHT标准品：纯度为99.2%，C[**]S 号 为 128–37–0，德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；

  没食子酸对照品：纯度为99.2%，C[**]S 号 为149–91–7，北京盈有限公司；

  山梨酸标准品：1 000 mg／ML，C[**]S 号为 110–44–1，北京盈有限公司；

  橄榄油、花生油、大豆油：1 L／瓶，市售；

  实验用水由 Milli-Q 超纯水系统制备。

1.2 仪器工作条件

  色谱柱：Waters XTerra RP–C18 柱 [250 mm×4.6 mm，5 μm，北京盈有限公司；流动相：[**] 为乙腈，B 为 H2O( 含体积分数为 0.4% 的冰乙酸 ) ；梯度洗脱程序见表 1 ；流量：0.8 mL／min ；柱温：40℃；检测波长：280 nm ；进样体积：10 μL。

1.3 溶液的配制

  PG 标准溶液：1 000 μg／mL，称取 10.1 mg PG

  标准品于 10 mL 容量瓶中，加入适量乙腈溶解，再加乙腈稀释至标线，摇匀；

  TBHQ 标准溶液：1 000 μg／mL，称取 10.0 mg TBHQ 标准品于 10 mL 容量瓶中，加入乙腈稀释至标线，摇匀；

  BH[**] 标 准 溶 液：1 000 μg／mL，称 取 10.1 mg BH[**] 标准品于 10 mL 容量瓶中，加入适量乙腈溶解，再用乙腈稀释至标线，摇匀；

  BHT 标 准 溶 液：1 000 μg／mL，称 取 10.1 mg BHT 标准品于 10 mL 容量瓶中，加入适量乙腈溶解，再加乙腈稀释至标线，摇匀；

  没食子酸标准溶液：1 000 μg／mL，称取 10.2 mg 没食子酸对照品于 10 mL 容量瓶中，加适量甲醇 + 水 (9∶1) 溶解，再加入乙腈稀释至标线，摇匀；

  山梨酸标准溶液：1 000 μg／mL，移取适量山梨酸标准品于标准试剂瓶中，即得；

  系列混合标准工作溶液：精确移取适量的上述6 种标准溶液于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至标线，摇匀，制成质量浓度均分别为 0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg／mL 的系列混合标准工作溶液。

1.4 样品前处理

  精密称取约 2.000 g 样品，加入 10 mL 正己烷溶解，然后用 10 mL 饱和正己烷的乙腈萃取，振荡，超声 25 min，离心后取乙腈层，定容至 10 mL，过 0.45μm 滤膜，待测。

1.5 标准工作曲线的建立

分别移取 10 μL 的系列混合标准工作溶液，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以 6 种合成抗氧化剂的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

2 结果与讨论

2.1 检测方法优化

2.1.1 流动相及流量

  结合化合物的结构和性质，借鉴 GB／T 21927–2008《食品中叔丁基对苯二酚的测定 高效液相色谱法》和 GB／T5009.29–2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》中相应的检测方法，初步选择乙腈、甲醇作为流动相中的有机相，水、乙酸水溶液、乙酸铵水溶液作为流动相中的水相。

  分别比较了乙酸水溶液 + 甲醇、水 + 甲醇、乙酸铵水溶液 + 甲醇、乙酸水溶液 + 乙腈、水 + 乙腈 5种流动相对测定结果的影响。结果表明，乙酸水溶液 + 甲醇作为流动相时，无论怎样调整洗脱梯度，各化合物的色谱峰均不够尖锐，跨度较大，不利于定量，且极性相近的化合物易重叠，这对定性、定量均有一定的困难；水 + 甲醇、水 + 乙腈这两类流动相也有类似的问题；乙酸铵水溶液 + 甲醇作为流动相时，山梨酸保留时间约为 6.5 min，没食子酸的保留时间小于 2.5 min，而 BHT 的保留时间大于 15 min，这说明乙酸铵水溶液的极性过大，故可以确定乙酸铵水溶液 – 甲醇不适合作为此 6 种化合物分析的流动相。综合考虑，确定流动相为乙酸水溶液 + 乙腈。选择 1% 乙酸水溶液 + 乙腈作为流动相时，峰形尖锐对称，但 6 种化合物的保留时间不合适，如没食子酸和 PG 的保留时间偏短，而 BH[**] 和 BHT 的保留时间偏长；选择水 + 乙腈作为流动相时，峰形尖锐且对称，没食子酸和 PG 的保留时间适中，约为 4～5 min，但山梨酸、TBHQ、BH[**]、BHT 的保留时间则偏长；结合上述两种流动相的优势，最终选择 0.4% 乙酸水溶液 + 乙腈作为流动相。

  采取梯度洗脱，以减少分析时间，提高分离效率，为了更好地控制各化合物的保留时间，最终确定流动相的流量为 0.8 mL／min。

2.1.2 检测波长

流动相和梯度洗脱程序确定后，采集检测波长分别为 210，251，280，460 nm 时的光谱，6 种合成抗氧化剂标准样品吸收光谱图见图 1。

由图 1 可知，6 种合成抗氧化剂的 λmax 各不相同，PG ：λmax = 298 nm ；TBHQ ：λmax = 210 nm ；BH[**] ：λmax = 216 nm ；BHT ：λmax = 210 nm ；没食子 酸：λmax = 298 nm ；山 梨 酸：λmax = 251 nm。 但TBHQ 的光谱图显示其在 260～320 nm 之间有完整吸收峰，而 BHT 则在 260～300 nm 之间有完整吸收峰，这两个吸收峰应为 TBHQ 和 BHT 的特征吸收峰。多波长同时检测能选择各化合物的最佳吸收波长，能有效提高目标化合物的检测灵敏度，但其定性定量谱图则比较凌乱，综合考虑，最终选择 280 nm作为 6 种合成抗氧化剂的检测波长，在此波长下，各形态完全基线分离，峰形对称、尖锐，满足检测要求。

2.2 提取方法优化

2.2.1 提取方式

  依据相关文献及化合物本身的结构性质分析，结合 GB／T 21927–2008《食品中叔丁基对苯二酚的测定 高效液相色谱法》中 TBHQ 的提取方法，并根据简单便捷、减少交叉污染的原则，最终选择超声提取方式。

2.2.2 提取溶剂

  6 种合成抗氧化剂均为极性相对较强的化合物，其中 4 种为脂溶性物质，2 种为水溶性物质。提取溶液应选择与流动相较为一致的试剂，因此分别考察了甲醇 – 水溶液、乙腈 – 水溶液、乙腈 – 乙酸水溶液、乙腈等有机溶剂作为提取溶液时 6 种合成抗氧化剂的回收效果。

  首先固定超声时间为 15 min，选择最优的提取溶剂。准确称取 2 g 油脂样本，加入 10 mL 正己烷溶解，然后用 10 mL 甲醇 – 水 (9∶1) 溶液超声萃取2 次，合并萃取液，氮吹浓缩，再用甲醇 – 水 (9∶1) 溶液定容至 10 mL，过滤膜，上机检测，TBHQ，BH[**]，BHT 的 回 收 率 为 60.4%～71.3%，PG，山 梨 酸 和 没食子酸的回收率为 75.7%～80.9% ；选用乙腈 – 水(9∶1) 溶液作为提取溶剂时，TBHQ，BH[**]，BHT 的回收率为 66.7%～75.6%，PG，山梨酸和没食子酸的回收率为 78.2%～84.1% ；选用乙腈 – 乙酸水 (9∶1)溶液作为提取溶剂时，TBHQ，BH[**]，BHT 的回收率为 56.1%～68.6%，PG、山梨酸、没食子酸的回收率为 76.9%～87.3% ；选用乙腈作为提取溶剂时，6 种合成抗氧化剂的回收率为 71.2%～80.6%。结果表明，提取溶剂中减少水或乙酸水强水溶性成分，有利于更好地提取油脂中的 TBHQ，BH[**]，BHT，而对G、山梨酸、没食子酸 3 种化合物的影响不大，因此先将正己烷和乙腈按照 1∶5 的体积比例混溶，待静止后分层，可以得到饱和正己烷的乙腈，然后按照上述方法提取油脂中的 6 种合成抗氧化剂，回收率为82.4%～90.6%，该方法满足检测要求，减少了提取次数，而且避免了氮吹。为了提高样品的提取效率，简化提取步骤，最终确定提取溶剂为饱和正己烷的乙腈溶液。

2.2.3 超声时间

  适当增加超声时间，萃取液定容至 10 mL，过滤膜，上机检测。结果表明，回收率在 79.4%～89.9%之间，没有显著下降。考察超声时间分别为 5，10，15，20，25，30，35，40 min 时，6 种化合物的加标回收率变化趋势见图 2。由图 2 可知，个别化合物的回收率在不同时间段有显著差异，总体而言，随着超声时间的延长，6 种化合物的回收率升高，当超声时间达到 25 min 后，回收率变化不明显，因此选择超声时间为 25 min。

2.3 色谱图

  6 种抗氧化剂标准样品的液相色谱图见图 3。由图 3 可知，6 种抗氧化剂在 15 min 内即可分离完全，峰形尖锐，表明该方法适于进行定量分析。

2.4 线性方程及检出限

  按照 1.5 方法绘制标准工作曲线。选取空白样本，加入已知浓度混合对照品溶液，稀释至最低出峰浓度，取 3 倍信噪比（S／N）时作为方法的定性检出限浓度，取 10 倍信噪比时作为方法的定量检出限浓度。根据加入空白样质量、定容体积、检出限浓度计算该方法的检出限。6 种抗氧化剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表 2。

由表 2 可知，6 种抗氧化剂的质量浓度在 0.1～10μg／mL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数大于 0.999，方法检出限为 1.0~2.5 mg／kg。

2.5 精密度与加标回收试验

  选择橄榄油、花生油、大豆油 3 种空白样品，分别准确称取约 2.000 g 共 18 份，每 6 份为一组，分别添加 0.2，1.0，2.0 μg／mL 的混合标准溶液，按照 1.4方法进行样品前处理，在 1.2 仪器工作条件下连续测定 6 次，测定结果见表 3。由表 3 可知，样品加标回收率为 79.6%～108.9%，测定结果的相对标准偏差为 2.03%～5.77%。表明该方法具有良好的精密度和准确度。加标样品的色谱图见图 4。

3 结语

通过优化流动相、检测波长、提取溶剂、提取时间等，建立了高效液相色谱法测定食用植物油中 6种合成抗氧化剂的含量。该方法简单、快速，能有效检测食用植物油添加的抗氧化剂。